液体内沉淀试验.ppt

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1、第六章第六章 沉淀反应沉淀反应第六章第六章 沉淀反应沉淀反应第一节第一节 沉淀反应的特点沉淀反应的特点第二节液体内沉淀试验第二节液体内沉淀试验 一、絮状沉淀试验一、絮状沉淀试验 二、免疫浊度测定二、免疫浊度测定第三节凝胶内沉淀试验第三节凝胶内沉淀试验 一、单向扩散试验一、单向扩散试验 二、双向扩散试验二、双向扩散试验第四节第四节 免疫电泳技术免疫电泳技术 一、对流免疫电泳一、对流免疫电泳 二、火箭免疫电泳二、火箭免疫电泳 三、免疫电泳三、免疫电泳 四、免疫固定电泳四、免疫固定电泳思考题思考题小结小结第一节第一节 沉淀反应原理及特点沉淀反应原理及特点沉淀反应沉淀反应（precipitation）

2、是指是指可溶性可溶性抗原与相应抗体抗原与相应抗体在在适当条件适当条件（PHPH、电、电解质等）解质等）下发生特异性结合而出现的下发生特异性结合而出现的沉淀现象沉淀现象,其特性与经典的抗原抗体反其特性与经典的抗原抗体反应相同。应相同。1898年Kraus首次发现毒素-抗毒素的沉淀现象；1905年Bechgold 发现沉淀可以在明胶中进行；1965年Mancini发明单向免疫扩散技术；上世纪70年代免疫浊度法出现。上述技术的发明发展，使得沉淀反应向快速、准确、微量、自动化方向发展，在医学检验中的应用越来越广泛。形成肉眼可见的大的免疫形成肉眼可见的大的免疫复合物。沉淀线或沉淀环复合物。沉淀线或沉淀环

3、的观察以及免疫比浊法中的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段的终点法就是测定此阶段形成的复合物形成的复合物第一阶段第一阶段第二阶段第二阶段沉淀反应分两个阶段沉淀反应分两个阶段抗原抗体特异性结合，快抗原抗体特异性结合，快速但不可见。免疫比浊法速但不可见。免疫比浊法中的速率法就是利用此阶中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的段测定免疫复合物形成的速率。速率。经典的沉淀反应在第二阶段观察或测量沉淀线或沉淀环等来判断结果，称为终点法需要几十分钟到数小时；在第一阶段测定免疫复合物形成的速率，称为速率法。免疫免疫浊度浊度测定测定絮状絮状沉淀沉淀试验试验单向单向扩散扩散试验试验双向双向扩散扩散试

4、验试验对流免疫电泳对流免疫电泳火箭免疫电泳火箭免疫电泳免疫电泳免疫电泳免疫固定电泳免疫固定电泳液体液体内沉淀内沉淀试验试验凝胶凝胶内沉淀内沉淀试验试验凝胶凝胶免疫免疫电电泳技术泳技术沉淀反应可分三类沉淀反应可分三类第二节液体内沉淀试验第二节液体内沉淀试验 絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。形成肉眼可见的絮状沉淀物。方法受抗原抗体比例的影响非常明显方法受抗原抗体比例的影响非常明显应用于测定抗原抗体反应的最适比例应用于测定抗原抗体反应的最适比例(三种类型三种类型)一、

5、一、絮状沉淀试验絮状沉淀试验抗原稀释法：抗原最适比例抗原稀释法：抗原最适比例抗体稀释法：抗体最适比例抗体稀释法：抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例絮状沉淀试验絮状沉淀试验将抗原作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的沉淀物随抗原量的变化而不同。抗原抗体比例适当时，形成的沉淀物最多。将抗体作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的沉淀物随抗体量的变化而不同。将以上两种方法结合，将抗原抗体同时稀释，找出最佳比例。表表6-1 6-1 最适比方阵测定法最适比方阵测定法抗体抗体稀释度稀释度抗原稀释度抗原稀释度1/101/101/201/201/40

6、1/401/801/801/1601/1601/3201/3201/6401/640对照对照1/51/5+1/101/10+1/201/20+1/401/40+1/801/80+当当可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度的改变。的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度的改变。利用现代光学测量仪器与自动化检测分析相结合利用现代光学测量仪器与自动化检测分析相结合对浊度进行测定从而检测微量抗原或抗体对浊度进行测定从而检测微量抗原或抗体。原原 理

7、理二、免疫浊度测定二、免疫浊度测定1.1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量高剂量钩状反应(high dose hook effect)：当抗原过剩时，形成的IC分子小，而且容易离解，浊度反而下降。用抗体检测抗原，当反应液中抗体过量时，在一定范围内，IC的形成量与抗原量的递增正比，当抗原量递增至抗原抗体最佳比例时，IC的形成到达高峰。如再增加抗原量，IC的形成量反而减少。因此，如检测时抗原过量则得出错误的检测结果。反应体系中保持抗体过量。2.2.抗体的质量抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力：特异性强，效价高，亲和力强并使用强并使用R R型抗体型抗体

8、(等价带宽等价带宽)3.3.抗原抗体反应液的最适抗原抗体反应液的最适PHPH为为6.56.58.5 8.5 4.4.使用增浊剂使用增浊剂影响因素影响因素免疫浊度测定免疫浊度测定1.1.透射免疫比浊法透射免疫比浊法2.2.散射免疫比浊法散射免疫比浊法 3.3.免疫胶乳比浊法免疫胶乳比浊法 分类分类免疫浊度测定免疫浊度测定l经典的沉淀试验有四个缺点无法克服：操作繁琐；灵敏度低(10-100g)；时间长；难以自动化。第三节凝胶内沉淀试验第三节凝胶内沉淀试验 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓

9、度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。烯酰胺凝胶。要求：要求：1 1、单价特异性抗血清（是指血清只与其、单价特异性抗血清（是指血清只与其特异性抗原发生反应）；特异性抗原发生反应）；2 2、标准品；、标准品；3 3、灵敏度、灵敏度1.251.25g/ml原理原理原理：抗体与待测的抗原原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正环的大小与抗原的浓度成正相关。相关。技术要点：将抗体混入技术要点

10、：将抗体混入0.9%0.9%琼琼脂糖内（脂糖内（5050），未凝固前倾），未凝固前倾注成平板，凝固后打孔（注成平板，凝固后打孔（直径直径3 35 5mmmm ），孔中加入抗原溶），孔中加入抗原溶液和不同浓度的标准品，置湿液和不同浓度的标准品，置湿盒内盒内37,2437,244848h h 观察孔周观察孔周围是否出现沉淀环。围是否出现沉淀环。定量试验定量试验 一、单向扩散试验一、单向扩散试验 （平板法）（平板法）倾注平板打孔加样倾注平板打孔加样 放置放置373724244848h h观察沉淀环观察沉淀环 单向扩散试验（平板法）单向扩散试验（平板法）沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法沉淀环的直

11、径与待测标本含量两种计算方法ManciniMancini曲线：曲线：大分子抗原（大分子抗原（IgMIgM）时间扩散时间扩散4848h h，常数常数K KCdCd2 2普通坐标纸曲线普通坐标纸曲线 FaheyFahey曲线：曲线：小分子抗原（小分子抗原（IgG,IgAIgG,IgA）扩散时间扩散时间2424h h常数常数K KlogCd logCd 半对数坐标纸曲线半对数坐标纸曲线 C C为抗原浓度，为抗原浓度，d d为沉淀环直径为沉淀环直径单向扩散试验单向扩散试验 （平板法）（平板法）T T1 1为为16162424h h；T T2 2为为24244848h h；T T3 3为为4848h h

12、以以上上,可见可见T T3 3为直线，为直线，T T1 1为反抛物线为反抛物线t t1 1为为16162424h h；t t2 2为为24244848h h；t t3 3为为4848h h以以上上,可见可见t t1 1为直线，为直线，t t3 3为反抛物线为反抛物线ManciniMancini曲线曲线FaheyFahey曲线曲线影响因素：影响因素：抗体质量抗体质量标准曲线标准曲线 ，质控血清，质控血清结果与真实含量不符结果与真实含量不符单克隆抗体单克隆抗体+多态性抗原多态性抗原=假性假性降低；降低；多克隆抗体多克隆抗体+单克隆病单克隆病=假性升假性升高；高；双环现象双环现象抗原性相同、扩散率不

13、同的两抗原性相同、扩散率不同的两个组分：个组分：重链病人血清中的重链病人血清中的重链与正常重链与正常IgA单向扩散试验单向扩散试验上排为上排为5 5个不同浓度的参考品；个不同浓度的参考品；下下排排为为患患者者血血清清，下下排排右右2 2为为异异常常病病理血清理血清 单向扩散试验单向扩散试验 （平板法）（平板法）原理：将抗原抗体原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖分别加在琼脂糖不同的对应孔中，不同的对应孔中，两者在凝胶中自两者在凝胶中自由扩散，在比例由扩散，在比例合适处形成白色合适处形成白色沉淀线。沉淀线。技术要点：平板玻璃上倾注一层均技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔匀的琼

14、脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为径为3 3mmmm，孔间距在孔间距在3 35 5 mmmm之间，之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒置湿盒371837182424h h 后，观察孔周后，观察孔周围是否出现沉淀环。围是否出现沉淀环。鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一 二、双向扩散试验二、双向扩散试验 （平板法）（平板法）1.1.抗原或抗体的存在与否以抗原或抗体的存在与否以及相对含量及相对含量(位置位置)的估计的估计2.2.抗原或抗体相对分抗原或抗体相对分子量（形状）的估计子量（形状）的估计 双向扩散试验双向扩散试验 （平板

15、法）（平板法）应用应用3.3.抗原性质的分析抗原性质的分析 双向扩散试验双向扩散试验 （平板法）（平板法）AbAbAbAbAbAb应用应用4.4.抗体效价的滴定抗体效价的滴定 5.5.抗原或抗体纯度抗原或抗体纯度的鉴定的鉴定 :MixAg+Ab/MixAb+AgMixAg+Ab/MixAb+Ag=one band(pure)/=one band(pure)/several band(impure)several band(impure)双向扩散试验双向扩散试验 （平板法）（平板法）简单易行，用途广泛；简单易行，用途广泛；灵灵敏敏度度低低1.251.25g/mlg/ml，反应慢，不能精确定量反应

16、慢，不能精确定量双向扩散试验双向扩散试验 （平板法）（平板法）第四节免疫电泳技术第四节免疫电泳技术优点：优点：1.1.加快反应的速度。加快反应的速度。2.2.提高了灵敏度提高了灵敏度（g/ml）。）。3.3.增加了分辨率。增加了分辨率。电泳分析电泳分析沉淀反应沉淀反应抗原抗体反应抗原抗体反应的高度特异性的高度特异性电泳技术的高电泳技术的高分辨率、快速、分辨率、快速、微量微量免疫电泳技术免疫电泳技术原理：双向扩散原理：双向扩散+电泳电泳比双向扩散试验灵比双向扩散试验灵敏度提高敏度提高8 8 1616倍倍技术要点：制备技术要点：制备1.2%1.2%巴比妥巴比妥琼脂凝胶板，在其上成对打琼脂凝胶板，在

17、其上成对打孔，孔径孔，孔径3 3mmmm，孔距孔距6 6 mmmm，于阴极侧孔内加待测血清，于阴极侧孔内加待测血清，阳性侧孔加抗血清，电泳条阳性侧孔加抗血清，电泳条件件3 34mA/cm4mA/cm，30min30min1 1h h，pH8.6 bufferpH8.6 buffer。一、对流免疫电泳一、对流免疫电泳蛋白质抗原常蛋白质抗原常带较强的负电带较强的负电荷，在电场中荷，在电场中向正极移动向正极移动抗体球蛋白抗体球蛋白(PI6-7)(PI6-7)带负电荷较少，带负电荷较少，籍电渗籍电渗(水流水流)作用向负极泳作用向负极泳动动 对流免疫电泳对流免疫电泳IgG3/IgG4IgG3/IgG4I

18、gG1/IgG2IgG1/IgG2结果分析：结果分析：无沉淀线出现则表明无相无沉淀线出现则表明无相应的抗原。应的抗原。沉淀线位于抗原抗体孔中沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。间，说明两者比例较适合。沉淀线偏向抗原孔一方，沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度抗原，反表示抗体浓度抗原，反之，则是抗体浓度抗原之，则是抗体浓度抗原浓度。浓度。对流免疫电泳对流免疫电泳+电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀

19、线逐渐变窄，抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。原量呈正相关。原理原理单向免疫扩散电泳单向免疫扩散电泳,定量检测技术定量检测技术二、火箭免疫电泳二、火箭免疫电泳1.2%1.2%巴比妥琼脂糖约巴比妥琼脂糖约5555，加入适量抗血，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧，样品孔放负极侧，6h 6h后观察琼脂板上沉后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。淀峰，绘制标准曲线，求

20、出待测样品浓度。技术要点技术要点火箭免疫电泳火箭免疫电泳火箭免疫电泳图火箭免疫电泳图为标准抗原；为标准抗原；为标本为标本-+火箭免疫电泳示意图火箭免疫电泳示意图沉淀峰高沉淀峰高抗原浓度抗原浓度1.1.测定沉淀峰高度测定沉淀峰高度2.2.在标准曲线上查找在标准曲线上查找 相应抗原浓度相应抗原浓度绘制标准曲线绘制标准曲线染色标本结果染色标本结果火箭免疫电泳火箭免疫电泳1.1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。2.2.电泳终点时间的确定（电泳终点时间的确定（云雾状、圆形云雾状、圆形火箭窄峰火箭窄峰）。）。3.3.标本数量多时应先通电后加样标本

21、数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形防止宽底峰形.4.IgG4.IgG定量时，可用甲醛与定量时，可用甲醛与IgGIgG上的氨基结合（甲酰化）上的氨基结合（甲酰化），只带负电荷，抵消了电渗作用。，只带负电荷，抵消了电渗作用。影响因素影响因素火箭免疫电泳火箭免疫电泳提高灵敏度：免疫自显影技术（加入提高灵敏度：免疫自显影技术（加入125125I I标记的标准抗标记的标准抗原，免疫竞争性法检测目的抗原）原，免疫竞争性法检测目的抗原）原理：区带电泳双向扩散原理：区带电泳双向扩散1 1、将蛋白质抗原在凝胶中电、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区泳分成肉眼不可见的若干区带带 2 2、沿电泳方向挖

22、一与之平行、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散进行双向扩散 。技术要点：制备琼脂板技术要点：制备琼脂板打孔，加样于孔内，电打孔，加样于孔内，电泳泳2 23 3mA/cmmA/cm ，0.50.51 1h h后，槽内加入相应抗血后，槽内加入相应抗血清作双向扩散。清作双向扩散。三、免疫电泳三、免疫电泳纯化抗原和抗体成分的分析及正常和纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定异常免疫球蛋白的识别与鉴定影响因素影响因素抗原抗体比例不当抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比需测抗原抗体最适比 抗血清的的抗体谱抗血清的的抗体谱 ，混合抗血清的使

23、用，混合抗血清的使用电泳条件直接影响分辨率电泳条件直接影响分辨率应用应用免疫电泳免疫电泳+-免疫电泳示意图免疫电泳示意图骨髓瘤血清骨髓瘤血清正常人血清正常人血清AlbuminAlpha 1Alpha 2Beta Gamma免疫电泳原理，不同之处是将抗免疫电泳原理，不同之处是将抗血清直接加于电泳后的蛋白质区血清直接加于电泳后的蛋白质区带表面，抗原抗体在凝胶中直接带表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物，经染色后，可抗原抗体复合物，经染色后，可对对各类免疫球蛋白及其轻链进行各类免疫球蛋白及其轻链进行分型分型 原理原理区带电泳沉淀反应区带电泳

24、沉淀反应四、免疫固定电泳四、免疫固定电泳先将患者血清或血浆先将患者血清或血浆(未变性未变性)在在醋纤膜或琼脂上作区带电泳，根醋纤膜或琼脂上作区带电泳，根据血清蛋白质的电荷不同将其分据血清蛋白质的电荷不同将其分开，然后将开，然后将IgGIgG、IgAIgA、IgMIgM、轻轻链和链和轻链的抗血清加于分离的轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道，参考泳道则加蛋白蛋白质泳道，参考泳道则加蛋白质固定剂，用于区带对照，作用质固定剂，用于区带对照，作用一定时间后洗去游离蛋白质，染一定时间后洗去游离蛋白质，染色后则可见被固定的相应色后则可见被固定的相应M M蛋白成蛋白成分。分。技术要点技术要点免疫固定电泳免疫固定

25、电泳左图为左图为IgG IgG 型型,中图为中图为IgG IgG 型，右为正常型，右为正常（无（无单链单链）SP G AM SP G AM SPG AM 免疫固定电泳示意图免疫固定电泳示意图Antibody:分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。数小时，结果易于分析。应用应用最常用于最常用于M M蛋白的鉴定与分型，也蛋白的鉴定与分型，也用于尿中本周氏蛋白质的检测与用于尿中本周氏蛋白质的检测与、分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测与分型。测与分型。优点优点免疫固定电泳免疫固定电泳M蛋白：经免疫电泳及化学分析证明蛋白：经

26、免疫电泳及化学分析证明它是由单克隆浆细胞分泌的结构均一它是由单克隆浆细胞分泌的结构均一的免疫球蛋白或多肽链亚单位的免疫球蛋白或多肽链亚单位(轻链轻链)，即单克隆免疫球蛋白，或称即单克隆免疫球蛋白，或称M蛋白。蛋白。1.1.主要用于血液、体液中蛋白质的测定。主要用于血液、体液中蛋白质的测定。2.2.优点：稳定性好，敏感度高，精确度高，简便快优点：稳定性好，敏感度高，精确度高，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染，适合大批量速，易于自动化，无放射性核素污染，适合大批量标本检测。标本检测。3.3.对流免疫电泳与火箭免疫电泳技术由于电渗的缘对流免疫电泳与火箭免疫电泳技术由于电渗的缘故已不推荐使用。故

27、已不推荐使用。4.4.免疫电泳扩散时间长，影响因素多，结果不易分免疫电泳扩散时间长，影响因素多，结果不易分析。析。5.5.免疫固定电泳分辨力强，敏感度高，结果易于分免疫固定电泳分辨力强，敏感度高，结果易于分析，常用于析，常用于M M蛋白的鉴定与分型。蛋白的鉴定与分型。沉淀反应在医学检验中的应用沉淀反应在医学检验中的应用沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出的沉淀现象生特异性结合而出的沉淀现象.根据沉淀反应介质和根据沉淀反应介质和检测方法的不同，将其分为液体内沉淀试验、凝胶内检测方法的不同，将其分为液体内沉淀试验、凝胶内沉淀试

28、验和凝胶免疫电泳试验三大基本类型。沉淀试验和凝胶免疫电泳试验三大基本类型。免疫浊法度测定为液体内沉淀试验；单向扩散试验平免疫浊法度测定为液体内沉淀试验；单向扩散试验平板法是一种定量的凝胶内沉淀试验，免疫电泳技术是板法是一种定量的凝胶内沉淀试验，免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物，常见的有对流免疫电泳分析与沉淀反应的结合产物，常见的有对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等。电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等。小小 结结1.1.什么是沉淀反应？什么是沉淀反应？2.2.沉淀反应的特点？沉淀反应的特点？3.3.免疫浊度法的原理、方法与分类？免疫浊度法的原理、方法与分类？4.4.单向扩散试验的原理和应用？单向扩散试验的原理和应用？5.5.免疫固定电泳的原理及临床应用价值？免疫固定电泳的原理及临床应用价值？6.6.何谓何谓ManciniMancini曲线？曲线？7.7.何谓何谓FaheyFahey曲线？曲线？8.8.影响免疫比浊测定的因素有哪些？影响免疫比浊测定的因素有哪些？9.9.抗原性质分析出现哪三种结果现象？结果解释？抗原性质分析出现哪三种结果现象？结果解释？10.10.自动化免疫比浊法发展趋势和应用前景？自动化免疫比浊法发展趋势和应用前景？思考题思考题