蛋白质的分离纯化剖析641.ppt

《蛋白质的分离纯化剖析641.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质的分离纯化剖析641.ppt（61页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 第一节第一节 引言引言(ynyn)(ynyn)n蛋白质存在于一切蛋白质存在于一切(yqi)生物体中，是非常重要的生生物体中，是非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能。别等多种生理功能。第二章第二章 蛋白质别离纯化蛋白质别离纯化(chn hu)(chn hu)原理与原理与技术技术第一页，共六十一页。一、别离纯化一、别离纯化(chn hu)的意义的意义从生物材料中别离制备蛋白质，研究其结构与功能，从生物材料中别离制备蛋白质，研究其结

2、构与功能，对于了解生命活动的规律对于了解生命活动的规律(gul)，说明生命现象，说明生命现象的本质有重大意义。的本质有重大意义。工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。基因工程的需要基因工程的需要第二页，共六十一页。二、别离纯化二、别离纯化(chn hu)的要求的要求1 1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究、纯

3、度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，到达一定纯度一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，到达一定纯度即可，不要求均一。即可，不要求均一。2 2、活性：要求大分子保持、活性：要求大分子保持(boch)(boch)天然构象状态，有高度的生天然构象状态，有高度的生物活性。物活性。3 3、收率：希望收率越高越好，但在别离纯化过程中总有不少损、收

4、率：希望收率越高越好，但在别离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。失。而且提纯步骤越多，损失越大。第三页，共六十一页。三、别离三、别离(fnl)纯化的一般程序纯化的一般程序蛋白质分子的别离纯化一般可分为以下几个阶段蛋白质分子的别离纯化一般可分为以下几个阶段(jidun)：材料的选择和预处理材料的选择和预处理 破碎细胞及提取有时还需要进行细胞器的别离破碎细胞及提取有时还需要进行细胞器的别离 别离纯化：包括粗分级别离和细分级别离别离纯化：包括粗分级别离和细分级别离其中前两个阶段为别离纯化的前处理。其中前两个阶段为别离纯化的前处理。第四页，共六十一页。第二节第二节 蛋白质别离纯化蛋白

5、质别离纯化(chn hu)(chn hu)的前处理的前处理一、材料的选择与预处理一、材料的选择与预处理选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、本钱低的动植物组织或微生物做原料。科研选材本钱低的动植物组织或微生物做原料。科研选材那么无需考虑上述问题，只要能到达实验目的即那么无需考虑上述问题，只要能到达实验目的即可。可。实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组料需要除去一些与

6、实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工尽快加工(ji gng)处理。假设不立即进行实验处理。假设不立即进行实验或加工或加工(ji gng)，应冷冻保存。，应冷冻保存。第五页，共六十一页。二、细胞二、细胞(xbo)的破碎的破碎n别离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原别离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然来的天然(tinr

7、n)状态，不丢生物活性。因此应选状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但假设材料是体液择适当的方法将组织和细胞破碎。但假设材料是体液如血或生物体分泌到体外的分泌物，那么不必进如血或生物体分泌到体外的分泌物，那么不必进行组织细胞的破碎。行组织细胞的破碎。第六页，共六十一页。n组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。n一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。超声

8、波处理破碎。n植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能到达目的。起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能到达目的。n细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压高压(g

9、oy)挤压或溶菌酶处理以分解肽聚糖。挤压或溶菌酶处理以分解肽聚糖。第七页，共六十一页。三、细胞器的别离三、细胞器的别离(fnl)n细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。n如果如果(rgu)要别离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防要别离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器别止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器别离出来，然后在某一细胞器中别离某一物质。离出来，然后在某一细胞器中别离某一物质。n细胞器的别离一般采用差速离心

10、法，即将破碎后的细胞在适当的介质细胞器的别离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经屡次分步离心后，即可获得所需组分。管的不同部位，经屡次分步离心后，即可获得所需组分。第八页，共六十一页。四、提取四、提取(tq)n组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件含

11、物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分下和溶剂中，让制备物充分(chngfn)溶解，溶解，并尽可能保持原来的天然状态，防止因长久放并尽可能保持原来的天然状态，防止因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是提取。置造成制备物的分解破坏，这就是提取。第九页，共六十一页。1 1、蛋白质的提取、蛋白质的提取(tq)(tq)n大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L的

12、磷酸盐缓的磷酸盐缓冲液冲液pH7.0-7.5或或0.1mol/L Tris-HClpH7.5-8.0缓冲液作提取液。缓冲液作提取液。n对于一些和脂质结合比较牢固对于一些和脂质结合比较牢固(log)或分子中非极性或分子中非极性较多的蛋白质，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提较多的蛋白质，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中参加适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、取液中参加适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。正丁醇等。第十页，共六十一页。第三节第三节 蛋白质别离蛋白质别离(fnl)(fnl)纯化纯化n从细胞中提取得到的蛋白质往往是不纯的，含从细胞中提取得到的蛋白质往往是不纯的，含

13、有大量杂质，必须进一步别离有大量杂质，必须进一步别离(fnl)纯化，纯化，这一阶段可分为粗分级别离和细分级别离两步这一阶段可分为粗分级别离和细分级别离两步进行。进行。第十一页，共六十一页。一、蛋白质的别离一、蛋白质的别离(fnl)(fnl)纯化纯化n蛋白质别离蛋白质别离(fnl)纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。n 性质性质 方法方法n分子大小分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤n 溶解度溶解度 等电点沉淀、

14、盐析、有机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀n电荷电荷 电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析n吸附性质吸附性质 吸附层析羟基磷灰石层析、疏水作用层析吸附层析羟基磷灰石层析、疏水作用层析n对配体分子对配体分子 亲和层析亲和层析n 的生物亲和力的生物亲和力第十二页，共六十一页。主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白淀等方法，使目的蛋白(dnbi)与其它较大量的与其它较大量的杂蛋白杂蛋白(dnbi)分开，这些方法的特点是简便、分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白白(

15、dnbi)质，但分辨率低。质，但分辨率低。1 1、粗分级别离、粗分级别离第十三页，共六十一页。1 1盐析盐析(yn x)(yn x)l向蛋白质溶液中参加大量的中性盐向蛋白质溶液中参加大量的中性盐 NH4)2SO4NH4)2SO4，Na2SO4Na2SO4，使蛋，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。l盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子(lz)(lz)与水分子作用，与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大局部的自由水转变为盐离子使水的活度降低，原来溶液中大局部的自由水转变为盐离子(lz)(lz)的水化水

16、，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子外表的水化层，使蛋白聚集沉淀。同时盐离子破坏蛋白质分子外表的水化层，使蛋白聚集沉淀。同时盐离子(lz)(lz)可以中和蛋白质的外表电荷，也促进蛋白的沉淀。可以中和蛋白质的外表电荷，也促进蛋白的沉淀。第十四页，共六十一页。l 不同的蛋白质分子，由于其分子外表的极性基团不同的蛋白质分子，由于其分子外表的极性基团的种类的种类(zhngli)(zhngli)、数目以及排布的不同，其水化、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一

17、样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：别沉淀。如：血清血清(xuqn(xuqng)g)球蛋球蛋白白清清蛋蛋白白(dn(dnbi)bi)(NHNH4 4)2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度100%100%饱和饱和析出析出析出析出分段盐析分段盐析第十五页，共六十一页。2 2等电点沉淀等电点沉淀(chndin)(chndin)n蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液有关，随溶液pHpH变化而变化。在溶液变化而变化。在溶液pHpH值等于蛋白值等于蛋白质等电点时，蛋白质

18、的溶解度最小。质等电点时，蛋白质的溶解度最小。n不同不同(b tn)(b tn)的蛋白质有不同的蛋白质有不同(b tn)(b tn)的等电点，因此通过的等电点，因此通过调节溶液调节溶液pHpH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。第十六页，共六十一页。3 3有机溶剂法有机溶剂法n与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇(y chn)、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。n有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：有机溶剂引起蛋白

19、质变性的原因有两个：n降低水的介电常数，使蛋白质分子外表可解离基团降低水的介电常数，使蛋白质分子外表可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。分子的聚集沉淀。n是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。分子沉淀。第十七页，共六十一页。室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。假设预先且伴随着变性。假设预先(yxin)(yxin)将有机溶剂将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐参加蛋白质冷却，然后在不断搅拌下将其

20、逐渐参加蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，那么在溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，那么在很大程度上解决变性问题。很大程度上解决变性问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂别离不同的蛋白质。的有机溶剂别离不同的蛋白质。第十八页，共六十一页。2 2、细分级别离、细分级别离n一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大局一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大局部被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析部被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析

21、及电泳方法。及电泳方法。n常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。水吸附层析、亲和层析。n常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。泳。n另外，结晶另外，结晶(jijng)也是蛋白质别离纯化的方法之也是蛋白质别离纯化的方法之一，制备的结晶一，制备的结晶(jijng)物常常作为蛋白质结构分物常常作为蛋白质结构分析之用。析之用。第十九页，共六十一页。酶的活力酶的活力(hul)(hul)测定测定n在酶的制备过程在酶的制备过程(guchng)(guchng)中，每一步骤都应测

22、定留用中，每一步骤都应测定留用以及准备弃去局部中所含酶的总活力和比活力，以了解以及准备弃去局部中所含酶的总活力和比活力，以了解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而决定这一经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而决定这一步的取舍。步的取舍。n总活力总活力=活力单位活力单位/ml/ml酶液酶液总体积总体积mlmln比活力比活力=总活力单位数总活力单位数/总蛋白氮总蛋白氮mgmgn纯化倍数纯化倍数=每次比活力每次比活力/第一次比活力第一次比活力n回收率产率回收率产率=每次总活力每次总活力/第一次总活力第一次总活力100%100%第二十页，共六十一页。第四节第四节 蛋白质纯度蛋白质纯度(chnd)

23、(chnd)鉴定鉴定n生物大分子经过别离提纯，最后还要鉴定生物大分子经过别离提纯，最后还要鉴定(jindng)(jindng)制品制品的纯度。的纯度。n蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-SDS-聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法、免疫化学法、法、免疫化学法、N-N-末端氨基酸分析法等。末端氨基酸分析法等。n纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场它的电泳图

24、谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。中，应以单一的沉降速度移动。n选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用必须同时采用2-32-3种不同的方法才能确定。种不同的方法才能确定。第二十一页，共六十一页。第五节第五节蛋白质的层析别离蛋白质的层析别离n应用广泛。特征：有一个固定相和一个流动相。由于待应用广泛。特征：有一个固定相和一个流动相。由于待别离的各种物质在这两个相分配系数不同，当两个相作别离的各种物质在这两个相分配系数不同，当两个相作相对运动时，这些物质在两相间反复屡次分配，结果使相对运动时

25、，这些物质在两相间反复屡次分配，结果使其相互分开。其相互分开。n根据两相的状态，层析法可分为：气相层析和液相层析；根据两相的状态，层析法可分为：气相层析和液相层析；按层析原理可分为：吸附按层析原理可分为：吸附(xf)(xf)层析、分配层析、离子层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。按操作形式分交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。按操作形式分为：柱层析、薄层层析、纸层析等。为：柱层析、薄层层析、纸层析等。第二十二页，共六十一页。第二十三页，共六十一页。n 分配系数分配系数:k=C:k=Cs s/C/Cm m,物质物质(wzh)(wzh)在固定相与流动相浓度之比。在固定相与流动相

26、浓度之比。质量分配系数：质量分配系数：D=kD=kVs/Vm,Vs,Vm 为固定相和流动相的为固定相和流动相的体积。体积。一、层析一、层析(cn x)(cn x)的一般原的一般原理理 3216168816812412412228 如果柱顶参加如果柱顶参加32mg32mg样品样品(yngpn)(yngpn)，样品，样品(yngpn)(yngpn)的质量的质量分配系数分配系数D D为为1 1，即样品在两相中是，即样品在两相中是等量分配。经过等量分配。经过5 5层的平衡分配后，层的平衡分配后，样品在柱的分配情况见图。样品集样品在柱的分配情况见图。样品集中在中间。如果中在中间。如果D1D1D1，样品集

27、中在中，样品集中在中间偏下。间偏下。第二十四页，共六十一页。离子交换层析离子交换层析(IEX)是根据电荷来别离分子是根据电荷来别离分子(fnz)的。的。离离子子交交换换剂剂是是通通过过化化学学反反响响将将解解离离基基团团引引入入到到惰惰性性支支持持物上形成的。分为：物上形成的。分为：阳离子交换剂阳离子交换剂:解离基团带负电解离基团带负电,结合阳离子结合阳离子;阴离子交换剂阴离子交换剂:解离基团带正电解离基团带正电,结合阴离。结合阴离。蛋蛋白白质质分分子子是是两两性性物物质质。当当pHpI，分分子子带带负负电电，可可结结合合阴阴离离子子交交换换剂剂；当当pHpI，分分子子带带正正电电，可可结结合

28、合阳阳离离子子交交换剂。如阳离子交换剂与带正电蛋白质分子之间有如下平衡：换剂。如阳离子交换剂与带正电蛋白质分子之间有如下平衡：二、离子交换二、离子交换(lzjiohun)层析层析一根本原理一根本原理第二十五页，共六十一页。带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。由于由于pHpH可改变可改变蛋白质的带电性质和带电量，盐离子会影响蛋白质在交换剂上吸蛋白质的带电性质和带电量，盐离子会影响蛋白质在交换剂上吸附。所以用附。所以用一定一定(ydng)浓度的盐溶液或一定浓度的盐溶液或一定(ydng)pH 的缓冲液的缓冲液就就可把蛋白质可把蛋白质从离子交换剂上从离子交换剂上

29、洗脱下来。对多组分混合物，每洗脱下来。对多组分混合物，每种分子所带的电荷不同，因此，可用不同的离子强度种分子所带的电荷不同，因此，可用不同的离子强度或不同或不同的的pHpH溶液将蛋白质从交换剂上一一溶液将蛋白质从交换剂上一一洗脱下来。洗脱下来。第二十六页，共六十一页。二离子交换二离子交换(l z jio(l z jio hun)hun)剂的根本类型剂的根本类型 根根据据可可供供交交换换的的离离子子的的性性质质，离离子子交交换换剂剂可可被被分分为为(fnwi)阳阳离离子子交交换换剂剂和和阴阴离离子子交交换换剂剂。假假设设按按酸酸碱碱性性的的强强弱弱，又又可可分分为为(fnwi)强酸、强碱、弱酸、

30、弱碱几种类型的离子交换剂。强酸、强碱、弱酸、弱碱几种类型的离子交换剂。强强酸酸和和强强碱碱型型交交换换剂剂能能在在较较广广泛泛的的pH范范围围内内pH212完完全全解解离离。弱弱酸酸型型交交换换剂剂在在低低于于pH4、弱弱碱碱型型交交换换剂剂在在高高于于pH9就就难难于于解解离离，因因而而失失去去交交换换能能力力。因因为为一一般般蛋蛋白白质质在在pH68之之间间稳稳定定，所以常用弱酸或弱碱型交换剂。所以常用弱酸或弱碱型交换剂。第二十七页，共六十一页。离子交换离子交换(lzjiohun)基团的结构和性质基团的结构和性质类型类型名称名称结构式结构式性质性质DEAE二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基(di

31、ethylaminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)2弱碱性弱碱性QAE季胺乙基季胺乙基(quaternaryaminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3强碱性强碱性Q季胺季胺(quaternaryamine)-CH2-N+-(CH3)3强碱性强碱性CM羧甲基羧甲基(carboxymehyl)-O-CH2-COO-弱酸性弱酸性SE磺乙基磺乙基(sulfoethyl)-O-CH2CH2-SO3-强酸性强酸性SP磺丙基磺丙基(sulfopropyl)-O-CH2-CH2-CH2-SO3-强酸性强酸性P磷酸基磷酸基(phosphate)-O-PO3-中酸性中酸

32、性S磺酸基磺酸基(sulfonate)-CH2-SO3-强酸性强酸性第二十八页，共六十一页。可可用用来来作作为为交交换换剂剂支支持持物物的的物物质质种种类类较较多多。早早期期用用于于别别离离氨氨基基酸酸、小肽和其它小分子物质的离子交换树脂小肽和其它小分子物质的离子交换树脂(shzh)的支持物是聚苯乙烯类。的支持物是聚苯乙烯类。别别离离蛋蛋白白质质的的常常用用的的亲亲水水性性支支持持物物。有有三三大大类类：纤纤维维素素、葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶(sephadex)、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶(sepharose)和和合合成成凝凝胶胶(Trisacryl和和Fractogel)。1、离子交换、离子交换(l

33、z jio hun)纤维素纤维素 离离子子交交换换纤纤维维素素是是以以纤纤维维素素做做支支持持介介质质的的。具具有有松松散散的的亲亲水水性性网网络络，较较大大的的外外表表积积，吸吸附附容容量量大大，通通透透性性好好。根根据据离离子子交交换换纤纤维维素素所所含含离离子子交交换换基基团团的的性性质质可可分分为为强强酸酸、强强碱碱型型和和弱弱酸酸、弱弱碱碱型型。现现将将常常用用的的离离子子交换纤维素列于下表中。交换纤维素列于下表中。第二十九页，共六十一页。常用常用(chnyn)的离子交换纤维素的离子交换纤维素离子(lz)类型 解 离 基 团特 点DEAE-OCH2CH2N+(C2H5)在 pH8.6

34、 应用(yngyng)第三十页，共六十一页。阴离子阴离子解离基团解离基团交换交换摩尔摩尔(mmol/g)特点特点DEAEOCH2CH2N(C2H5)0.11.1在在pH4应用应用POPO3H20.77.4酸性较强酸性较强SEOCH2CH2SO3H0.20.3强酸性强酸性第三十二页，共六十一页。在Sephadex上接上某种离子交换基团(j tun)。这种凝胶既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。因此，其别离能力比单纯的层析凝胶或离子交换剂好。葡聚糖凝胶离子交换剂的交换量比相应的纤维素离子交换剂大，如DEAESephadex的交换量大约是DEAE纤维素的3.55.0倍。2、离子交换、离子交换(l

35、z jio hun)葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶Sephadex第三十三页，共六十一页。葡聚糖凝胶离子交换葡聚糖凝胶离子交换(lzjiohun)剂的性质剂的性质类别类别离子交换基团离子交换基团床体积床体积ml/g分离范围分离范围(Mr)交换量交换量总交换容量总交换容量(mmol/g)强阳离子交强阳离子交换剂换剂SESephadexC25C50-CH2CH2SO3H5932383104-21053104-21052.02-52.02-5SPSephadexC25C50-CH2CH2CH2SO3H 2.30.3弱阳离子交弱阳离子交换剂换剂CMSephadexC25C50-O-CH2COOH61032403

36、104-21053104-2105 4.50.5第三十四页，共六十一页。强阴离子交换剂强阴离子交换剂QAESephadexA25A505830403104-21053104-21053.04.0弱阴离子交换剂弱阴离子交换剂DEAESephadexA25A50-C2H4N+(C2H5)2H5925833104-21053104-21053.54.5类别类别离子交换基团离子交换基团床体积床体积ml/g分离范围分离范围(Mr)交换量交换量总交换容量总交换容量(mmol/g)-O-C2H4N+(C2H5)2第三十五页，共六十一页。将各种离子基团引入到交联琼脂糖将各种离子基团引入到交联琼脂糖(Speha

37、rose CL)和大孔合成凝胶和大孔合成凝胶(Trisacryl或或Fractogel)上，那么形上，那么形成一系列离子交换成一系列离子交换(l z jio hun)剂。这类交换剂剂。这类交换剂即坚硬、吸附容量大，形状球形，能维持较好的流速即坚硬、吸附容量大，形状球形，能维持较好的流速及分辨率。及分辨率。3、交联凝胶离子交换、交联凝胶离子交换(l z jio hun)剂剂第三十六页，共六十一页。三层析三层析(cn x)条件的选择条件的选择1、离子交换剂的选择、离子交换剂的选择 选择离子交换剂之前要了解选择离子交换剂之前要了解(lioji)样品的样品的性质：热稳定性、带电情况、性质：热稳定性、带

38、电情况、pH和盐浓度对其活和盐浓度对其活性和溶解度的影响。一般情况下，带负电的物质性和溶解度的影响。一般情况下，带负电的物质用阴离子交换剂，反之，那么用阳离子交换剂。用阴离子交换剂，反之，那么用阳离子交换剂。实验室中最广泛使用的是实验室中最广泛使用的是DEAE和和CM 交换剂。交换剂。2、交换颗粒大小的选择、交换颗粒大小的选择 粒子大小主要影响分辨率和流速。粒子大小主要影响分辨率和流速。粗粒子：粗粒子：交换容量小、间隙交换容量小、间隙(jin x)大、分辨率底、流速较快。大、分辨率底、流速较快。细粒子：分辨力高、交换容量大但是流速慢。细粒子：分辨力高、交换容量大但是流速慢。第三十七页，共六十一

39、页。3、层析缓冲液的选择、层析缓冲液的选择 选择正确的缓冲液可获得较好的层析效果。因为离子选择正确的缓冲液可获得较好的层析效果。因为离子相互作用取决于相互作用取决于pH，而维持介质的，而维持介质的pH，通常是由缓冲液，通常是由缓冲液来实现的。所用缓冲液的种类、来实现的。所用缓冲液的种类、pH大小，决定大小，决定 待别离待别离(fnl)组分的稳定性和溶解度。组分的稳定性和溶解度。为防止缓冲液的离子参与离子交换为防止缓冲液的离子参与离子交换(l z jio hun)过程，采用缓冲液所带的电荷应与离子交换过程，采用缓冲液所带的电荷应与离子交换(l z jio hun)剂所带电荷相同。使用阳离子交换剂

40、所带电荷相同。使用阳离子交换(l z jio hun)剂时，要用阴离子型缓冲液磷酸、醋酸等；使剂时，要用阴离子型缓冲液磷酸、醋酸等；使用阴离子交换用阴离子交换(l z jio hun)剂时要用阳离子型缓冲液剂时要用阳离子型缓冲液Tris、胺盐、吡啶等。、胺盐、吡啶等。第三十八页，共六十一页。要得到好的别离效果，层析时要注意层析柱的高度和体要得到好的别离效果，层析时要注意层析柱的高度和体积；上样量的大小；洗脱液体积；洗脱速度；分级物的收积；上样量的大小；洗脱液体积；洗脱速度；分级物的收集量。集量。1、柱床体积：至少要比结合所有样品所需要的要大、柱床体积：至少要比结合所有样品所需要的要大25倍。倍

41、。离子交换层析所用的柱不用离子交换层析所用的柱不用(byng)太长，以便缩短操作太长，以便缩短操作时间。时间。2、样品、样品pH 和离子强度：与起始缓冲液具有相同的和离子强度：与起始缓冲液具有相同的pH和离和离子强度。子强度。3、洗脱液体积和洗脱梯度的形状：对柱的分辨率影响很大。、洗脱液体积和洗脱梯度的形状：对柱的分辨率影响很大。洗脱可用恒定组成的缓冲液来完成简单洗脱也可用改洗脱可用恒定组成的缓冲液来完成简单洗脱也可用改变变pH或盐浓度，或二者均改变的洗脱液来完成。或盐浓度，或二者均改变的洗脱液来完成。pH和盐和盐浓度的改变又分为连续改变梯度洗脱和不连续改变浓度的改变又分为连续改变梯度洗脱和不

42、连续改变阶段洗脱阶段洗脱。四柱层析技术四柱层析技术(jsh)第三十九页，共六十一页。交换剂的处理就是将交换剂转变为适合别离交换剂的处理就是将交换剂转变为适合别离(fnl)目的的离子类型。一目的的离子类型。一般包括除杂质、溶胀，除细粒和改型。改型就是用适当的离子平衡，使交换剂般包括除杂质、溶胀，除细粒和改型。改型就是用适当的离子平衡，使交换剂带上希望的离子。阳离子和阴离子交换剂最后分别为带上希望的离子。阳离子和阴离子交换剂最后分别为Na和和Cl型是最稳定形式。型是最稳定形式。4、洗脱速度：太快或太慢都会降低、洗脱速度：太快或太慢都会降低(jingd)柱的分辨率。柱的分辨率。5、分级物收集量：关系

43、到能否充分代表层析柱的分辨率。一、分级物收集量：关系到能否充分代表层析柱的分辨率。一般总洗脱体积在般总洗脱体积在5002000ml时，每管收集时，每管收集510ml五离子交换五离子交换(l z jio hun)剂的处理和再生剂的处理和再生 离子交换剂价格较贵，用后再经过再生处理，可反复屡次使用。处理时防止用强酸或强碱长时间浸泡，以防载体的糖链结构遭水解破坏。第四十页，共六十一页。剂剂型型处处理用的酸或理用的酸或碱碱浓浓度度浸泡浸泡时间时间纤维纤维素素SephadexSepharose合成凝胶合成凝胶0.5MHCl或或NaOH(含含0.5MNaCl)0.1MHCl或或NaOH(含含1MNaCl)

44、1MNaAc(pH3.0)或或0.1MNaOH(含含1MNaCl)0.51.0MHCl或或NaOH(含含1MNaCl)34h0.5h可在柱中再可在柱中再生生长时间长时间浸泡浸泡无影响无影响各类离子交换各类离子交换(l z jio hun)剂的再生条件剂的再生条件第四十一页，共六十一页。血清蛋白常用离子交换层析别离。IgG可用QAESephadex A50或DEAESephadex A50别离。现在临床上有重要(zhngyo)用途的许多血清蛋白，如白蛋白，factor IX复合物和专一性免疫球蛋白已用离子交换层析大规模生产。六离子交换六离子交换(l z jio hun)层系的应用实例层系的应用实

45、例第四十二页，共六十一页。凝胶层析又称凝胶渗透层析、排阻层析，分子筛层析等。凝胶层析又称凝胶渗透层析、排阻层析，分子筛层析等。它主要用于别离分子大小不同的生物大分子及测定其分子量。它主要用于别离分子大小不同的生物大分子及测定其分子量。凝胶层析设备凝胶层析设备(shbi)简单，操作简便，每次层析后无需再生简单，操作简便，每次层析后无需再生处理，因此，在生化研究中应用及其广泛。处理，因此，在生化研究中应用及其广泛。三、凝胶过滤三、凝胶过滤(gul)层析层析第四十三页，共六十一页。凝胶层析载体是多孔凝胶。当溶质通过层析柱时，溶质分子不仅是向下运动，而且还在做无定向扩散运动。分子直径比凝胶孔径大的分子

46、，不能进入凝胶颗粒的微孔里，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙。这样的分子是随溶剂一起移动的，因而最先流出柱外；而分子直径比凝胶孔径小的分子，那么能够自由进入凝胶颗粒的微孔之中，即进入凝胶相内。小分子向下移动的速度必然(brn)要落后于大分子。凝胶颗粒是固定相，洗脱液是流动相。(一一)根本原理根本原理第四十四页，共六十一页。溶质分子在柱上移动的速度即被凝胶颗粒阻滞的程度决溶质分子在柱上移动的速度即被凝胶颗粒阻滞的程度决定于该分子在两相间的分配常数定于该分子在两相间的分配常数 Kd。Kd由下式计算：由下式计算：Kd=(Ve-Vo)/Vp 式中式中Ve为某种物质从柱内完全洗脱出来为某种物质从柱内完全洗脱出

47、来(ch li)时洗脱液的时洗脱液的体积；体积；Vo为胶粒之间空隙的总容积，也称外水体积；为胶粒之间空隙的总容积，也称外水体积；Vp为胶粒内为胶粒内部孔隙的总容积，称内水体积。假设分子大，完全不能进入胶粒部孔隙的总容积，称内水体积。假设分子大，完全不能进入胶粒微孔，那么最先流出柱，此时微孔，那么最先流出柱，此时Kd=0；假设分子小，能完全进入；假设分子小，能完全进入胶粒微孔，那么最胶粒微孔，那么最 后流出柱，此时后流出柱，此时Kd=1对中等大小的分子，只对中等大小的分子，只能局部进入胶粒微孔，所以能局部进入胶粒微孔，所以Kd值在值在01之间。不同溶质是按之间。不同溶质是按Kd由小到大的顺序流出

48、柱。由小到大的顺序流出柱。第四十五页，共六十一页。凝胶过滤法的分辨率是凝胶层析中的另一个重要的特征凝胶过滤法的分辨率是凝胶层析中的另一个重要的特征性常数。从数学概念性常数。从数学概念(ginin)上考虑，别离分辨率可以表示上考虑，别离分辨率可以表示为：为：V1、V2是两种物质的洗脱体积，可以从加样品开始到洗是两种物质的洗脱体积，可以从加样品开始到洗脱峰的最高点为止的洗脱体积计算。脱峰的最高点为止的洗脱体积计算。W1、W2分别为两个物质的洗脱峰的宽度，可以由通过峰边分别为两个物质的洗脱峰的宽度，可以由通过峰边拐点的两条切线与基线拐点的两条切线与基线(jxin)交点间的距离来计算。两个物交点间的距

49、离来计算。两个物质要完全别离，质要完全别离，必须大于或等于必须大于或等于1。影响分辨率的因素很多，。影响分辨率的因素很多，如凝胶粒度、上样量、流速、温度、凝胶类型及层析柱的形状如凝胶粒度、上样量、流速、温度、凝胶类型及层析柱的形状等。等。=2 V2-V1)W1+W2第四十六页，共六十一页。第四十七页，共六十一页。第四十八页，共六十一页。第四十九页，共六十一页。第五十页，共六十一页。第五十一页，共六十一页。第五十二页，共六十一页。第五十三页，共六十一页。第五十四页，共六十一页。第五十五页，共六十一页。第五十六页，共六十一页。第五十七页，共六十一页。第五十八页，共六十一页。第五十九页，共六十一页。第六十页，共六十一页。内容(nirng)总结第一节 引言。2、活性：要求大分子保持天然构象(u xin)状态，有高度的生物活性。别离纯化：包括粗分级别离和细分级别离。其中前两个阶段为别离纯化的前处理。一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。特征：有一个固定相和一个流动相。二乙基氨基乙基。1、柱床体积：至少要比结合所有样品所需要的要大25倍。W1+W2第六十一页，共六十一页。