免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析6345.pptx
《免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析6345.pptx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析6345.pptx(35页珍藏版)》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、免疫组化、免疫荧光、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较流式细胞术的应用比较及常见问题分析及常见问题分析宋砚明宋砚明song_yanmingwuxiapptec第一页,共三十五页。免疫组化免疫组化IHCIHC的应用介绍的应用介绍免疫荧光免疫荧光IFIF的应用介绍的应用介绍流式细胞术流式细胞术FCFC的应用介绍的应用介绍IHCIHC、IFIF、FCFC区别与联系区别与联系第二页,共三十五页。免疫组织化学原理及特点免疫组织化学原理及特点利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术,利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术,通过化学反响使标记抗体显色,对组织细胞内的特异性通过化学反响使标
2、记抗体显色,对组织细胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的一门技术。抗原进行定位、定性、定量检测的一门技术。免疫组化具有操作简单,特异性强,敏感性高,定位准免疫组化具有操作简单,特异性强,敏感性高,定位准确,形态与功能相结合等特点。确,形态与功能相结合等特点。免疫组织化学免疫组织化学Immunohistochemistry,IHCImmunohistochemistry,IHC第三页,共三十五页。细细 胞胞抗抗原原一一抗抗二二抗抗辣根过氧化物酶HRP3 3,3-3-二氨联苯胺二氨联苯胺DABDAB显色显色剂剂棕褐色络合物IHC反响原理示意图反响原理示意图第四页,共三十五页。组织切片组织切片
3、/芯片制作芯片制作第五页,共三十五页。2.组织芯片应用领域组织芯片应用领域组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的根底研究、临床研究、应用研究和新药开发根底研究、临床研究、应用研究和新药开发等。等。免疫组化染色免疫组化染色IHC;原位杂交原位杂交ISH;荧光原位杂交荧光原位杂交FISH;原位末端标记分析原位末端标记分析TUNEL;原位原位PCR以及激光捕获显微别离系统辅助以及激光捕获显微别离系统辅助的的cDNA杂交。杂交。1.组织芯片组织芯片组织芯片或组织微阵列是将数十个甚至上千个不同组织芯片或组织微阵列是将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相载
4、体上,组织芯片中含个体的组织标本集成在一张固相载体上,组织芯片中含有蛋白,有蛋白,RNA及及DAN分子,是一种高通量的研究分析工分子,是一种高通量的研究分析工具。研究者一次可有效利用成百上千份正常或疾病状态具。研究者一次可有效利用成百上千份正常或疾病状态下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的关系。病之间的关系。3.Abgent现有组织切片现有组织切片/芯片产品芯片产品全套鼠类器官组织切片;全套鼠类器官组织切片;全套猴类器官组织切片;全套猴类器官组织切片;人类常见癌症组织切片;人类常见癌症组织切片;组织芯片客户定制效劳。组织芯片客
5、户定制效劳。组织芯片组织芯片/切片应用切片应用第六页,共三十五页。免疫组化流程示意图免疫组化流程示意图第七页,共三十五页。2.SP法法原理:根据生物素原理:根据生物素(Biotin)与链霉亲和素与链霉亲和素(Streptavidin)具有强结合力的原理设计。在一抗兔源与鼠源与相具有强结合力的原理设计。在一抗兔源与鼠源与相应的靶抗原结合后,生物素化标记的抗多价二抗与一抗应的靶抗原结合后,生物素化标记的抗多价二抗与一抗特异结合;二抗上标记的生物素与标记了辣根过氧化物特异结合;二抗上标记的生物素与标记了辣根过氧化物酶酶HRP的链霉亲和素结合,形成抗原特异性一抗的链霉亲和素结合,形成抗原特异性一抗生物
6、素化的二抗生物素化的二抗HRP标记的链霉亲和素复合物。标记的链霉亲和素复合物。特点:该法孵育时间短通常为特点:该法孵育时间短通常为10min,灵敏度,灵敏度高以及低背景染色等特点。高以及低背景染色等特点。1.SABC法法原理:原理:SABC法是利用链酶亲和素(Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲和力这一生物学性质,先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合,形成生物素化HRP,然后与链酶亲和素按一定比例混合,形成SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合,再与SABC复合物联结形成抗原抗体生物素化二抗 SABC复合物。最后用底物显色剂显色。特点:特点:该法具有灵敏度高
7、以及低背景染色等特点。3.Polymer酶标二抗法酶标二抗法原理:原理:该法采用一段多聚氨基酸聚合物做为载体链,将该多聚物与二抗结合,然后可再标记上多个HRP/AP酶分子,所以同样具有很高的信号放大作用。特点:特点:灵敏度高;操作步骤简单;无需进行内源性的生物素封闭。IHC二抗原理及选择二抗原理及选择4.直接酶标二抗法直接酶标二抗法该法是将该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗上。因此酶分子直接标记于二抗上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实验简单,本钱低,需要普通的酶标二抗即可完成。实验简单,本钱低,但是因为没有信号放大作用,所以对很多表达丰度但是因为没有信号放大作用,所以对很多表达丰度不
8、是很高的抗原就可能检测不到。不是很高的抗原就可能检测不到。第八页,共三十五页。IHC常用酶标二抗原理示意图常用酶标二抗原理示意图第九页,共三十五页。2.AEC显色法显色法产品描述:产品描述:3-氨基氨基-9-乙基咔唑乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole,AEC)是过氧化物酶是过氧化物酶(Peroxidase)的显色底物,在过氧化物酶的催化下,的显色底物,在过氧化物酶的催化下,AEC显色工作液会于反响部位产生溶于酒精的红色显色工作液会于反响部位产生溶于酒精的红色沉淀,必须在水溶性介质中复染和封片。本试剂盒沉淀,必须在水溶性介质中复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶适用于
9、辣根过氧化物酶HRP系统的免疫组化显系统的免疫组化显色,包括色,包括AEC显色原和与之配套的稀释液。显色原和与之配套的稀释液。试剂盒组成:试剂盒组成:AEC显色原试剂显色原试剂AAEC底物缓冲液试剂底物缓冲液试剂B1.DAB显色法显色法产品描述:二氨基联苯胺产品描述:二氨基联苯胺(3,3-diaminobenzidine,DAB)是过氧化物酶是过氧化物酶(Peroxidase)的显色底物,在过氧化物酶的显色底物,在过氧化物酶的催化下,的催化下,DAB显色工作液会于反响部位产显色工作液会于反响部位产生不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用生不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶于辣根
10、过氧化物酶HRP系统的免疫组化系统的免疫组化显色。显色。试剂盒组成:试剂盒组成:DAB显色原显色原20试剂试剂ADAB底物缓冲液底物缓冲液1试剂试剂B3.BCIP/NBT显色法显色法产品描述:产品描述:BCIP/NBT5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸吲哚磷酸/氮蓝四唑氮蓝四唑是一种冷藏稳定的、单一组分溶液,用于免疫组化、是一种冷藏稳定的、单一组分溶液,用于免疫组化、原位杂交、原位杂交、westernblot、northernblot和和southernblot,特异性地与碱性磷酸酶,特异性地与碱性磷酸酶AP反响生成紫色物质。反响生成紫色物质。试剂盒组成:试剂盒组成:有机溶剂中的有机溶剂中的5-
11、溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四唑吲哚磷酸和氮蓝四唑IHC显色方法原理及选择显色方法原理及选择4.BCIP/INT显色法显色法产品描述:产品描述:BCIP/INT5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸吲哚磷酸/p-碘碘硝基四唑是一种冷藏稳定的、单一组分溶液,用硝基四唑是一种冷藏稳定的、单一组分溶液,用于免疫组化、原位杂交、于免疫组化、原位杂交、westernblot、northernblot和和southernblot,特异性地与碱性磷酸酶反响,特异性地与碱性磷酸酶反响生成橙色生成橙色/棕褐色物质。棕褐色物质。试剂盒组成:试剂盒组成:有机溶剂中的有机溶剂中的5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸和吲哚
12、磷酸和p-碘硝碘硝基四唑基四唑第十页,共三十五页。免疫组织化学结果分析免疫组织化学结果分析第十一页,共三十五页。2.非特异性显色非特异性显色石蜡切片脱蜡不彻底,建议延长脱蜡时间。操作过程中冲洗不充分,建议增加冲洗的次数与冲洗时间。组织富含内源性的生物素与过氧化物酶,建议使用相关试剂进行封闭。发生抗原异位。蛋白封闭不充分,建议增加蛋白封闭时间。1.显色过深显色过深一抗浓度过高或孵育时间过长,建议降低一抗浓度或减少孵育时间。孵育温度过高,建议室温或4孵育。HRP标记二抗孵育时间过长,建议缩短时间。3.显色强度弱显色强度弱一抗浓度过低或孵育时间过短,建议增加一抗浓度或延长孵育时间。试剂超过保质期,建
13、议实验前确认试剂的保质期。操作过程冲洗过度,建议适度冲洗。免疫组织化学常见问题分析免疫组织化学常见问题分析4.无染色无染色组织中无目的抗原的表达。一抗种属来源与二抗不匹配,建议实验前确认一抗的种属来源。显色物质与HRP系统不匹配,建议实验前确认显色体系。第十二页,共三十五页。免疫荧光原理及特点免疫荧光原理及特点免疫荧光就是利用抗原与抗体的特异性结合原理及特殊的荧光素标记技术,免疫荧光就是利用抗原与抗体的特异性结合原理及特殊的荧光素标记技术,通过激光激发使荧光素发出荧光,在荧光显微镜下观察荧光的变化从而对通过激光激发使荧光素发出荧光,在荧光显微镜下观察荧光的变化从而对细胞内的抗原进行分析的技术。
14、用免疫荧光显示和检查细胞或组织内抗原细胞内的抗原进行分析的技术。用免疫荧光显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞或组织技术。或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞或组织技术。免疫荧光具有特异性强、敏感性高、速度快等特点。免疫荧光具有特异性强、敏感性高、速度快等特点。免疫荧光免疫荧光Immunofluorescence,IFImmunofluorescence,IF第十三页,共三十五页。免疫荧光原理示意图免疫荧光原理示意图第十四页,共三十五页。免疫荧光实验过程免疫荧光实验过程 细胞爬片多聚赖氨酸处理,生长密度细胞爬片多聚赖氨酸处理,生长密度70-80%70-80%细胞固定适宜的
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 免疫 荧光 细胞 应用 比较 常见问题 分析 6345
限制150内