组织培养愈伤组织培养资料.pptx
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1、 目的与要求目的与要求 了解胚状体概念,学习愈伤组织的离体培养方了解胚状体概念,学习愈伤组织的离体培养方式,掌握愈伤组织继代培养的培养基和培养条件,式,掌握愈伤组织继代培养的培养基和培养条件,了解继代培养物的分化,掌握愈伤组织培养的应了解继代培养物的分化,掌握愈伤组织培养的应用。用。具有胚状体概念、懂得愈伤组织诱导分化的阶具有胚状体概念、懂得愈伤组织诱导分化的阶段特点。具有愈伤组织的形态发生规律知能。段特点。具有愈伤组织的形态发生规律知能。第1页/共58页第一节第一节 愈伤组织的培养愈伤组织的培养第2页/共58页 愈伤组织培养是指将母体植株上的各个愈伤组织培养是指将母体植株上的各个部分切下,形
2、成外植体,接种到无菌的培养部分切下,形成外植体,接种到无菌的培养基上,进行愈伤组织诱导、生长和发育的一基上,进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。门技术。一般情况下,植物组织均能诱发形成愈一般情况下,植物组织均能诱发形成愈伤组织,由外植体形成愈伤组织,标志着植伤组织,由外植体形成愈伤组织,标志着植物离体培养的开始。物离体培养的开始。第3页/共58页一、愈伤组织的诱导一、愈伤组织的诱导(一)诱导原理(一)诱导原理1 1、细胞全能性、细胞全能性 植物每一细胞具有全套遗传信息,在特植物每一细胞具有全套遗传信息,在特定环境下能进行表达,而产生一个独立完定环境下能进行表达,而产生一个独立完整的个体。整
3、的个体。第4页/共58页 只要有一个完整的膜系统和一个只要有一个完整的膜系统和一个有生命力的核,即使已经是高度分化有生命力的核,即使已经是高度分化的植物细胞,也还保持恢复到分生状的植物细胞,也还保持恢复到分生状态的能力。其恢复能力取决于该细胞态的能力。其恢复能力取决于该细胞原来所处的部位和生理状态。原来所处的部位和生理状态。第5页/共58页2 2、脱分化现象、脱分化现象 一个已经停止分裂的成熟细胞转变为分一个已经停止分裂的成熟细胞转变为分生状态,并形成未分化的愈伤组织的现象。生状态,并形成未分化的愈伤组织的现象。植物离体培养中的脱分化过程植物离体培养中的脱分化过程:植物离体植物离体培养利用特定
4、的条件,促进细胞脱分化,使培养利用特定的条件,促进细胞脱分化,使原已分化并具有一定功能的细胞脱离原轨道,原已分化并具有一定功能的细胞脱离原轨道,失去其原有状态和功能,而恢复到未分化的失去其原有状态和功能,而恢复到未分化的愈伤组织状态。愈伤组织状态。第6页/共58页第7页/共58页3 3、诱导程度、诱导程度双子叶植物比单子叶植物容易双子叶植物比单子叶植物容易幼年细胞组织比成年细胞组织容易幼年细胞组织比成年细胞组织容易二倍体细胞比单倍体细胞容易二倍体细胞比单倍体细胞容易 第8页/共58页(二)诱导方法(二)诱导方法1 1、根据不同的培养目的,获取不同的外植、根据不同的培养目的,获取不同的外植体。体
5、。植株茎的切段、叶、根、花和种子,或某植株茎的切段、叶、根、花和种子,或某些组织切成片或块状,均可接种到培养基上。些组织切成片或块状,均可接种到培养基上。接种时需考虑材料的一致性,来源、产地、接种时需考虑材料的一致性,来源、产地、大小、形状、生理部位。常选组织块较大的材大小、形状、生理部位。常选组织块较大的材料。料。第9页/共58页 获取外植体材料消毒处理修整除去获取外植体材料消毒处理修整除去坏死组织切成坏死组织切成5mm5mm的圆柱形或方形小块的圆柱形或方形小块直放或倒放到培养基上每直放或倒放到培养基上每9cm9cm培养基接种培养基接种5 56 6块外植体培养。块外植体培养。2、操作程序 选
6、用较大组织做材料时,可用打孔器选用较大组织做材料时,可用打孔器从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织,切从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织,切成相同厚度的小圆片进行培养。成相同厚度的小圆片进行培养。第10页/共58页采用圆形的原因:采用圆形的原因:能得到外形简单结构相同的材料能得到外形简单结构相同的材料 圆形的表面积大圆形的表面积大 圆柱形的外植体有利于组织块与外界进圆柱形的外植体有利于组织块与外界进行物质和气体交换;也使外植体表面促进愈行物质和气体交换;也使外植体表面促进愈伤组织形成的分泌物较多,诱导率增高。伤组织形成的分泌物较多,诱导率增高。第11页/共58页培养基 MS培养基 激素 IAA、NA
7、A、2,4-D、BA 椰子汁、番茄汁、酵母提取物。第12页/共58页二、愈伤组织细胞的分化二、愈伤组织细胞的分化 单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织,大致经历三个时期,这三个时期中细组织,大致经历三个时期,这三个时期中细胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。第13页/共58页(一)诱导期(一)诱导期 诱导期是细胞正在准备分裂的时期。诱导期是细胞正在准备分裂的时期。1 1、诱导期、诱导期特征特征 细胞质增加,出现活跃的原生质流动,细胞质增加,出现活跃的原生质流动,贮藏物质淀粉等消失;随着组织的活化,细胞贮藏物质淀粉等
8、消失;随着组织的活化,细胞内核糖体增加并形成大量多聚核糖体;内核糖体增加并形成大量多聚核糖体;RNARNA迅迅速合成和累积;但细胞大小无多大变化。速合成和累积;但细胞大小无多大变化。第14页/共58页诱导期诱导期第15页/共58页2 2、影响愈伤组织诱导的因素、影响愈伤组织诱导的因素 植物种类、生理状况、外部因素不同,植物种类、生理状况、外部因素不同,诱导期不同。诱导期不同。弱光弱光下植株比强光下的植株外植体易于下植株比强光下的植株外植体易于诱导分裂诱导分裂 二氧化碳抑制诱导分化二氧化碳抑制诱导分化 生长调节剂诱导细胞开始分裂生长调节剂诱导细胞开始分裂 损伤剌激损伤剌激能加速脱分化进行,有时还
9、能加速脱分化进行,有时还是是某些材料能否脱分化的决定条件。某些材料能否脱分化的决定条件。第16页/共58页离体培养后细胞变化:离体培养后细胞变化:气体交换迅速增加;气体交换迅速增加;RNARNA出现;出现;蛋白质发生周期性变化;蛋白质发生周期性变化;酶水平变化。酶水平变化。第17页/共58页(二)分裂期(二)分裂期 分裂期是指细胞脱分化,细胞通过分裂期是指细胞脱分化,细胞通过分裂不断增生子细胞而形成愈伤组织的分裂不断增生子细胞而形成愈伤组织的过程。过程。植物分裂期脱分化规律:植物分裂期脱分化规律:胡萝卜等脱分化较禾谷类容易胡萝卜等脱分化较禾谷类容易 茎叶较花器脱分化茎叶较花器脱分化 幼嫩茎组织
10、比老组织较容易幼嫩茎组织比老组织较容易第18页/共58页分裂期分裂期第19页/共58页2 2、分裂期愈伤组织、分裂期愈伤组织特征特征:细胞数目增加、体积变小、核和核细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、仁变大、RNARNA含量持续上升。从培养外植含量持续上升。从培养外植体的形态变化来看,表现为外层细胞迅速体的形态变化来看,表现为外层细胞迅速分裂。当细胞体积最小,细胞核和核仁最分裂。当细胞体积最小,细胞核和核仁最大,大,RNARNA含量最高时,标志着细胞处于分含量最高时,标志着细胞处于分裂高峰时期。裂高峰时期。第20页/共58页魔芋愈伤组织(分裂期)第21页/共58页分化期主要分化期主要变化变化
11、为为 1 1、细胞分裂部位和方向发生改变、细胞分裂部位和方向发生改变 2 2、分生组织瘤状结构和维管组织形成、分生组织瘤状结构和维管组织形成 3 3、细胞体积不再减小、细胞体积不再减小 4 4、出现各种类型细胞、出现各种类型细胞 5 5、颜色变化、颜色变化第22页/共58页愈伤组织分化期第23页/共58页第二节第二节 愈伤组织的继代培养愈伤组织的继代培养第24页/共58页一、培养基和培养条件一、培养基和培养条件(一)培养基(一)培养基 常用于愈伤组织继代培养的培养基有常用于愈伤组织继代培养的培养基有MSMS、N6N6。第25页/共58页细胞分裂素细胞分裂素/生长素比例控制器官发生的模式:生长素
12、比例控制器官发生的模式:IAA/KTIAA/KT高,利于根形成高,利于根形成IAA/KTIAA/KT低,利于芽的分化低,利于芽的分化IAA/KTIAA/KT适中,则产生愈伤组织适中,则产生愈伤组织 第26页/共58页GA3GA3乙烯利乙烯利PP333PP333天然提取物:天然提取物:椰乳,浓度椰乳,浓度10%10%番茄汁,浓度番茄汁,浓度5-10%5-10%香蕉汁香蕉汁5 5,浓度,浓度-10%-10%第27页/共58页第28页/共58页注意:注意:-植物离体培养中,及时更换植植物离体培养中,及时更换植物生长物质的种类和浓度,才能有效物生长物质的种类和浓度,才能有效控制器官的分化。控制器官的分
13、化。-生长物质用量影响器官分化。生长物质用量影响器官分化。IAAIAA、IBAIBA处理根比较壮,处理根比较壮,2,4-D2,4-D对生根对生根不利。不利。BABA比比KTKT诱导芽效果强,诱导芽效果强,ZTZT作用作用窄。窄。第29页/共58页3 3、有机成分、有机成分 酪氨酸明显增强烟草组织的器官形成酪氨酸明显增强烟草组织的器官形成 酰胺类促进器官形成酰胺类促进器官形成 水解酪蛋白、水解乳蛋白为多种氨基酸混合物水解酪蛋白、水解乳蛋白为多种氨基酸混合物 腺嘌呤促进茎切段培养中芽的形成腺嘌呤促进茎切段培养中芽的形成 糖提供外植体能量,维持一定水势糖提供外植体能量,维持一定水势 第30页/共58
14、页4 4、物理性质、物理性质培养基形式、水势,对形态发生有明显影响培养基形式、水势,对形态发生有明显影响 诱导愈伤组织诱导愈伤组织-固态培养基固态培养基 细胞和体细胞胚增值细胞和体细胞胚增值-液态培养基液态培养基 胚状体发育成苗胚状体发育成苗-固态培养基固态培养基培养基培养基PHPH值对芽分化有影响值对芽分化有影响 5.5-6.05.5-6.0第31页/共58页(二)培养条件(二)培养条件1 1、光照、光照 愈伤组织培养中,某些植物诱导要求在愈伤组织培养中,某些植物诱导要求在黑暗中生长,大多数都需要光。黑暗中生长,大多数都需要光。有的葡萄品种对短日照敏感,烟草愈伤有的葡萄品种对短日照敏感,烟草
15、愈伤组织需要蓝光。组织需要蓝光。2 2、温度、温度 一般一般24242828,有些植物需要一定昼,有些植物需要一定昼夜温差。夜温差。第32页/共58页1 1、生理因素、生理因素 多次继代后不加多次继代后不加IAAIAA也可达到同样生长量。也可达到同样生长量。不同培养物保持分化潜力不同。不同培养物保持分化潜力不同。丧失分化能力的组织,加入腺嘌呤、酪蛋白、丧失分化能力的组织,加入腺嘌呤、酪蛋白、酵母汁后,可恢复一定分化能力。酵母汁后,可恢复一定分化能力。2 2、遗传因素、遗传因素 继代培养中易出现染色体紊乱,分化能力丧继代培养中易出现染色体紊乱,分化能力丧失与倍性不稳定有关。失与倍性不稳定有关。二
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