医学专题—细胞融合与单克隆抗体28325.ppt

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1、第四章第四章第四章第四章 细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体(kngt(kngt(kngt)山东师范大学生命科学学院山东师范大学生命科学学院(xuyun)(xuyun)第一页，共五十一页。第一节第一节 细胞融合概述细胞融合概述(i sh)第二页，共五十一页。细胞融合（细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过(tnggu)膜 融合形成单个细胞的过程。一、细胞融合的定义一、细胞融合的定义(dngy)第三页，共五十一页。uMuller于1838年观察到脊椎动的肿

2、瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。uVirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。uLuginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。uLange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。u1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有(jyu)触发动物细胞融合的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融

3、合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80年代出现了电融合技术。二、细胞融合研究进展二、细胞融合研究进展第四页，共五十一页。生物种类生物种类细胞来源细胞来源成功年代成功年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙人胡萝卜番茄马铃薯人小鼠叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶腹水癌细胞原生质体叶根尖纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞19721972197219721972

4、1972197219721972197219721972197219721972197219721972几种几种(j zhn)细胞融合成功的例子细胞融合成功的例子第五页，共五十一页。植物融合植物融合(rngh)细胞成长状态对比细胞成长状态对比,右瓶为地面右瓶为地面融合融合(rngh)的细胞，左瓶中为太空微重力环境下的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合融合(rngh)的细胞的细胞 第六页，共五十一页。动物细胞融合实验(shyn)使用的小白鼠 第七页，共五十一页。三、动植物细胞三、动植物细胞(xbo)的融合过程的融合过程植物植物(zhw)细胞融合过程细胞融合过程人造人造(rnzo)小鼠培育过程示意

5、图小鼠培育过程示意图第八页，共五十一页。四、细胞融合的意义四、细胞融合的意义(yy)u理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。u融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。的遗传物质交换提供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂

6、种的分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新亦可发生重组，从而产生新 的核外遗传系统。的核外遗传系统。u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体(kngt)的制备。的制备。第九页，共五十一页。第二节第二节 细胞融合的基本原理细胞融合的基本原理第十页，共五十一页。显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程(guchng)第十一页，共五十一页。融合过程融合过程(guchng)中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程(guchng)图解图解第十二页，共五十一页。用灭活的病毒

7、诱导的动物用灭活的病毒诱导的动物(dngw)细胞融合过程示意图细胞融合过程示意图 第十三页，共五十一页。第三节第三节 细胞融合的常用细胞融合的常用(chn yn)方法方法第十四页，共五十一页。一、仙台病毒法一、仙台病毒法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：两种细胞在一起培养，加入病毒，在4条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚；在37中，病毒与细胞膜发生反应(fnyng)，细胞膜受到破环，此时需 要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；融合成巨大细胞，仍需ATP。第十五页，共五十一页。病毒促使

8、细胞融合的主要病毒促使细胞融合的主要(zhyo)步骤如下：步骤如下：1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此(bc)靠近；2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；3.两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；4.进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。第十六页，共五十一页。用灭活的病毒用灭活的病毒(bngd)诱导的动物细胞融合过程示意图诱导的动物细胞融合过程示意图 第十七页，共五十一页。u 优点是易得，用法简单，融合效果稳定。u聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作细

9、胞融合剂。uPEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培养液为1g重)，即成50PEG溶液。uPEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。u通常(tngchng)用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50PEG溶液能产生 最多杂交细胞。uPEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。二、聚乙二醇（二、聚乙二醇（PEG）法）法第十八页，共五十一页。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程）法细胞融合过程(guchng)第十九页，共五十一页。PEG的作用机理的作用机理：Kao等认为，由于等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，分子具有轻微的负极性，故可以与具

10、有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成(xngchng)H键，从而在在质膜之间形成键，从而在在质膜之间形成(xngchng)分子桥，其结果分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。PEG诱导融合的特点诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制融合子产生的异核率较高；融

11、合过程不受物种限制(xinzh)。其。其缺点是融合过程繁琐，缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。可能对细胞有毒害。第二十页，共五十一页。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法细胞融合步骤细胞融合步骤（1）将两种不同亲本(qn bn)细胞各5l06混匀；（2）离心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37的CO2培养箱中培养。（6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。第二十一页，共五十一页。第二十二页，共五十一页

12、。三、电融合法三、电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：电融合法的优点：u融合率高、重复性强、对细胞伤害小；u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察(gunch)或录像观察(gunch)融合过程；u免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。第二十三页，共五十一页。电融合的基本过程：电融合的基本过程：细胞膜的接触：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电

13、流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个穿，从而导致两个(lin)紧密接触的细胞融合在一起。紧密接触的细胞融合在一起。第二十四页，共五十一页。电融合诱导法原理电融合诱导法原理(yunl)示意图示意图第二十五页，共五十一页。第三节第三节 杂种杂种(zzhng)细胞的筛选细胞

14、的筛选根据已经发生根据已经发生(fshng)融合的细胞中所含有核的类型，可将融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型：其分为以下几种类型：u异核细胞：非同源细胞的融合体。u同核细胞：两个相同细胞的融合体。u多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。第二十六页，共五十一页。u基于酶缺陷型细胞和药物(yow)抗性所建立的杂种筛选u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选u由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选u具有所需性状杂种细胞的筛选常用的杂种常用的杂种(zzhng)细胞筛选方法细胞筛选方法第二十七页，共五十一页。第四节第四节 细胞细胞(xbo)杂交瘤技术与单克隆抗体杂交瘤技术与单克隆抗体第二

15、十八页，共五十一页。一、何谓一、何谓(hwi)单克隆抗体？单克隆抗体？第二十九页，共五十一页。第三十页，共五十一页。第三十一页，共五十一页。第三十二页，共五十一页。只针对某一抗原决定簇的抗体分子只针对某一抗原决定簇的抗体分子(fnz)称为单克隆抗体称为单克隆抗体。第三十三页，共五十一页。单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定与经特定抗源免疫刺激的抗源免疫刺激的B淋巴细胞淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象

16、骨髓瘤，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此力。因此(ync)，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology）。）。第三十四页，共五十一页。Niels K.Jerne G.Kohler C.Milstein 第三十五页，共五十一页。二、杂交瘤技术二、杂交瘤技术(jsh)的基本原理的基本原理第三十六页，共五十一页。三、杂交瘤细胞三、杂交瘤细胞(xbo)的制备的制备（一）骨髓瘤细胞（一）骨髓瘤细胞(xbo)选择及选择性培养基选择及选

17、择性培养基骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择选择(xunz)次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十七页，共五十一页。HAT培养基培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基(nj)喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶(jmi)缺陷型（缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十八页，共五十一页。（二）免疫（二）免疫(miny

18、)小鼠小鼠 免疫程序是取68周龄BalbC雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，35天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理(chl)抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为loog，第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1l06一1107。第三十九页，共五十一页。（三）脾细胞（三）脾细胞(xbo)的制备的制备(1)(1)引颈处死小鼠，用酒精引颈处死小鼠，用酒精(jijng)(jijng)消毒体表；消毒体表；(2)(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用无菌条件下取出

19、脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml5ml无血清培养液冲洗一次；无血清培养液冲洗一次；(3)(3)把脾脏置于已消毒的把脾脏置于已消毒的9090一一100100目不锈钢网或尼龙纱网中；目不锈钢网或尼龙纱网中；(4)(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml3ml无血清培养无血清培养 液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；(5)(5

20、)把细胞悬液注入把细胞悬液注入50ml50ml离心管中，加离心管中，加l0l0一一20ml20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中培养液：轻轻吹打数次，室温中 置置5 5分钟；分钟；(6)(6)离心离心(800(800一一10001000转分转分)计数、备用。计数、备用。第四十页，共五十一页。（四）细胞（四）细胞(xbo)准备准备（1 1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3 3次次(37)(37)，计数活力，计数活力(hul)(hul)细胞细胞(不少于不少于9090)；（2 2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3 3次次(37)(

21、37)，并计细胞数和测定活力细胞；，并计细胞数和测定活力细胞；（3 3）按）按1 1：5 5或或1 1：1010混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤 纸吸纸吸 净多余上清。净多余上清。第四十一页，共五十一页。（五）细胞融合（五）细胞融合(1)将1ml 40的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微 转动离心管或用手指轻弹离心管；(2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完；(3)于5分钟内慢慢(mn mn)加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，(4)离心(800转分，8分钟)，去

22、上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5CO2，温箱中37培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。第四十二页，共五十一页。（六）融合（六）融合(rngh)后细胞培养后细胞培养(1)融合后710天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的)后每隔23天 半量换液一次；(2)两周后可改用HA培养液半量换液，或仍用HAT培养液；(3)23周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明；(4)待集落增殖生长(shngzhng)至13孔时，应进行抗体检测。第四十三页，共五十一页。HAT培养基培养基次黄嘌呤（h

23、ypoxanthine，H）氨基(nj)喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷(quxin)型（型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第四十四页，共五十一页。（七）抗体（七）抗体(kngt)检测检测免疫荧光试验(shyn)放射免疫试验(RIA)联免疫吸附试验(ELISA)第四十五页，共五十一页。（八）单克隆抗体（八）单克隆抗体(kngt)的大量制备的大量制备体内体内(t ni)法法培养法培养法第四十六页，共五十一页。四、单克隆抗体四、单克隆抗体(kngt)的

24、应用的应用单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病 诊断，以提高疾病诊断的准确性。诊断，以提高疾病诊断的准确性。利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅(bjn)能大大降低生产成能大大降低生产成 本，同时也增加了疫苗的安全性。本，同时也增加了疫苗的安全性。单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜 在技术。在技术。单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医

25、学的不单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不 断发展。断发展。第四十七页，共五十一页。第五节第五节 人源单克隆抗体人源单克隆抗体(kngt)主要困难主要困难（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本(qn bn)。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；（2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的；（3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。第四十八页，共

26、五十一页。第四十九页，共五十一页。本章本章(bn zhn)小结小结u细胞融合又称体细胞杂交，是两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融 合形成单个细胞的过程。u细胞融合的方法主要有生物法（仙台病毒法）、化学法（聚乙二醇 法）和物理(wl)法（电融合法）。u杂合细胞的筛选方法主要有基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂 种筛选、基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选、由温度敏感型细胞 组成的杂种细胞的筛选及具有所需性状杂种细胞的筛选。u基于细胞融合的杂交瘤技术和单克隆抗体技术具有广泛的应用价值。第五十页，共五十一页。内容(nirng)总结第四章 细胞融合与单克隆抗体。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2。通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透。（6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。对于细胞性抗原不用(byng)佐剂，每次腹腔注射1l06一1107。转动离心管或用手指轻弹离心管。合形成单个细胞的过程第五十一页，共五十一页。