荧光定量原理与分析方法.pptx

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1、内容概要内容概要1实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理1实时荧光定量实时荧光定量PCR的分类的分类1绝对定量分析方法简介绝对定量分析方法简介1相对定量分析方法简介相对定量分析方法简介1SYBR法实验流程及注意事项第1页/共63页实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析与常规 PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理定义定义第2页/共63页+扩增曲线+荧光阈值+Ct值实时荧光定量实时荧光定量PC

2、R原理原理常用名词概念常用名词概念第3页/共63页Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLogliner phaseLogliner phase荧光基团荧光检测元件实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理什么是扩增曲线什么是扩增曲线第4页/共63页Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLogliner phaseLogliner phase1 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）1 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动 设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过域值Thr

3、eshold实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理什么是荧光域值什么是荧光域值第5页/共63页Cycle（循环数）Rn（荧光强度）CtCt值的定义：值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value 实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理什么是什么是CtCt值值第6页/共63页横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量CtCt值的特点：值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性实时荧光定量PCR原理 CtCt值的重现性值的重现性第7页/共63页理想的PCR反应XnX0 2n*Xn：第n次循环

4、后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理第8页/共63页非理想的PCR反应XnX0 （1En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理第9页/共63页在扩增产物达到荧光阈值时XCtX0 （1En）CtM （1）*XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M方程式（1）两边同取对数得：LogMLogX0*（1En）Ct （2）整理方程式（2）：LogX0 L

5、og M CtLog（1En）实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理第10页/共63页Cycle numberCk 104Ck 102SampleLog of DNA concentration0 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少0 Log浓度与循环数呈线性关系LogX0 Log M CtLog（1En）实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理第11页/共63页内容概要内容概要1实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理1实时荧光定量实时荧光定量PCR的分类的分类1绝对定量分析方法简介绝对定量分析方法简介1

6、相对定量分析方法简介相对定量分析方法简介1SYBR法实验流程及注意事项第12页/共63页实时荧光定量PCR的分类不同的荧光标记方法不同的应用目的第13页/共63页特异性荧光标记：1.TaqMan 2.Molecular Beacon非特异性荧光标记：3.SYBR Green 实时荧光定量PCR的分类常用荧光标记方法常用荧光标记方法第14页/共63页1 1、TaqMan-TaqMan-水解型杂交探针水解型杂交探针+5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等+3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)+探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光+Ta

7、q酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针实时荧光定量PCR的分类第15页/共63页实时荧光定量PCR的分类TaqManTaqMan法的工作原理法的工作原理每扩增一条DNA分子释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光第16页/共63页 实时荧光定量PCR的分类1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：一般为：94，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号

8、/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同TaqMan TaqMan 法法PCRPCR反应的建立反应的建立第17页/共63页%对目标序列的高特异性 阴性结果确定%设计相对简单 与目标序列某一区域互补%重复性比较好优 点%只适合一个特定的目标%委托公司标记，价格较高%不易找到本底低的探针缺 点实时荧光定量实时荧光定量PCR的分类的分类TaqmanTaqman法优缺点法优缺点第18页/共63页+标记荧光的发夹探针+环与目标序列互补+茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂2 2、分子信标、分子信标(Molecular Beacon)(Molecular

9、 Beacon)实时荧光定量PCR的分类第19页/共63页实时荧光定量PCR的分类FRET分子信标工作原理分子信标工作原理第20页/共63页实时荧光定量PCR的分类分子信标优缺点分子信标优缺点+高特异性：对目标序列+检测SNP最灵敏的试剂之一+荧光背景低优 点+只能用于一个特定目标+设计困难+价格比较高缺 点第21页/共63页3 3、SYBR Green SYBR Green 法法SYBR Green SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光；变性时，DNA双链分开，无荧光 实时荧光定量PCR的分类第22页/共63页实时荧光定量PCR的分类SYBR Green SYBR Green

10、 染料染料SYBR Green 结合到DNA小沟部位示意图 第23页/共63页将温度与荧光强度的变化求导。将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)(-dI/dT)实时荧光定量PCR的分类原始图谱对数图谱SYBR GreenSYBR Green法融解曲线定义法融解曲线定义第24页/共63页融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确实时荧光定量PCR的分类SYBR GreenSYBR Green法融解曲线分析法融解曲线分析第25页/共63页%对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA%使用方便，不必设计复杂 探针%非常灵敏%具有价格优

11、势优 点%容易与非特异性双链DNA结 合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件%对引物特异性要求较高缺 点实时荧光定量PCR的分类SYBRSYBR方法的优缺点方法的优缺点第26页/共63页实时荧光定量PCR的分类几种方法的比较几种方法的比较方法优点缺点适用范围SYBR Green I 方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan 方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断Molecular Beacon法(分子信标)高特异性荧光背景低只

12、适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析第27页/共63页实时荧光定量PCR的分类不同的荧光标记方法不同的应用目的第28页/共63页.定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等.绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等.相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯片结果验证，差异显示结果验证等实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的应用技术的应用第29页/共63页内容概要内容概要1实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理1实时荧光定量实时荧光定量PCR的分类的分类1绝对定量分析方法简介绝对定量分析方法简介1相对定量分析方法简介相对定量分析方

13、法简介1SYBR法实验流程及注意事项第30页/共63页Sample25绝对定量分析方法简介绝对定量定义绝对定量定义0 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系0 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量第31页/共63页未知样品与已知浓度的标准曲线进行比较标准品的一些标准：必需用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同标准品必需是经过准确定量的（例如，用分光光度计定量）标准品必需是标准化的（例如，同一化的细胞数）在每组实验时，必需用相同的阈值设定来确定Ct值绝对定量分析方法简介绝对定量的标准品绝对定量的标准品

14、第32页/共63页绝对定量分析方法简介标准样品的制备标准样品的制备第33页/共63页拷贝数的计算待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v绝对定量分析方法简介第34页/共63页乙肝病人血液中HBV的绝对定量q 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据q 方法：从血液中提取

15、病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测q 试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）目录号（FP203）q 设置对照：浓度为106、105、104、103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照q 实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序q 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数绝对定量分析方法简介举例举例1第35页/共63页绝对定量举例：HBV病毒检测 以Taqman探针进行Sample:HBV阳性标准品，分别含有5103、5104、5105、5106 copies/mlcopies/mlCt1

16、Ct2Mean CtSTD510328.1828.6428.410.16510425.2525.1425.190.04510522.1122.4622.280.12510618.6318.9218.770.10BLANKNoneNone实验数据：绝对定量分析方法简介举例举例2第36页/共63页扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率 =10-1/-3.17 =2.03 E%=(2.03-1)100%=103%标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.17x+37.52 R2=0.9988绝对定量分析方法简介举例举例2第37页/共63页如未知样本Ct为20.5标准曲线制作：利用Me

17、anCt作图可得到标准曲线将Ct值带入线性方程：20.5=-3.1726 X+37.52X=20.5-37.517-3.1726=5.36QuantityUnknown=105.36 =229087 copies y=-3.17x+37.52 R2=0.9988绝对定量分析方法简介举例举例2第38页/共63页内容概要内容概要1实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理1实时荧光定量实时荧光定量PCR的分类的分类1绝对定量分析方法简介绝对定量分析方法简介1相对定量分析方法简介相对定量分析方法简介1SYBR法实验流程及注意事项第39页/共63页相对定量分析方法简介为什么要用相对定量为什么要用相对定量模

18、板均一性问题：起始的细胞数、细胞的状态、均一性等 RNA制备：RNA纯化得率、均一性等 反转录：反转录的效率等 第40页/共63页相对定量分析方法简介内参照内参照GAPDHBeta-actinbeta-2-microglobulin(B2M)ribosomal protein L13a(RPL13A)PPIA(Cyclophilin)ubiquitin C(UBC)eukaryotic translation initiation factors 4A(eIF4A)18S rRNA第41页/共63页方法：双标准曲线法 2 Ct 相对定量分析方法简介几种不同的相对定量方法几种不同的相对定量方法第

19、42页/共63页对照样品目的基因浓度待测样品参照基因浓度优点：分析简单，实验优化简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线；必需有固定的标准品做标准曲线；这些标准品并不代表样品扩增的真实状态应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一F=待测样品目的基因浓度对照样品参照基因浓度公式：相对定量分析方法简介双标准曲线法双标准曲线法第43页/共63页相对定量分析方法简介Ct法：法：公式：公式：优优点点：优化的体系建立后，每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可要求：要求：标准曲线斜率差值0.1缺缺点点：假定扩增效率为 100%；假定

20、标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂应用：应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一待测组目的基因平均Ct值待测组看家基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组看家基因平均Ct值F=2-第44页/共63页实验数据：Sample 处理前 处理后 Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100，且相对偏差不超过5Ct（处理前）18171 Ct（处理后）1617.4=1.4Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）1.412.4比率（处理后/处理前）=2Ct2（2.4）5

21、.3 所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5.3倍修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的或增效率，但扩增效率不等于2，那么2Ct可以修正为：ECt，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95Ct相对定量分析方法简介 Ct法举例第45页/共63页内容概要内容概要1实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理1实时荧光定量实时荧光定量PCR的分类的分类1绝对定量分析方法简介绝对定量分析方法简介1相对定量分析方法简介相对定量分析方法简介1SYBR法实验流程及注意事项第46页/共63页SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项样品制备模板准备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求

22、环境要求误差控制数据分析仪器介绍RT上机反应体系优化试剂选择分析方法第47页/共63页样品制备环境要求模板准备数据分析RT上机浓度确定SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具高纯度，浓度均一的高纯度，浓度均一的高纯度，浓度均一的高纯度，浓度均一的RNARNARNARNA分光光度计检测电泳检测第48页/共63页RT反应体系优化试剂选择样品制备模板准备数据分析上机AMVM-MLVQuantSuper下游反应数确定反转录体积选择应用引物高效、全长的高效、全长的高效、全长的高效、全长的cDNAcDNAcDNAcDNASYBR法实验

23、流程及注意事项法实验流程及注意事项第49页/共63页模板准备引物设计浓度确定环境要求误差控制RT样品制备数据分析上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间评价引物使用mix降低系统误差设置重复（3次）设置空白和阴性对照均一的反应液和模板混合物均一的反应液和模板混合物均一的反应液和模板混合物均一的反应液和模板混合物GC：5060Tm：5065单个碱基重复4个无二级结构扩增长度：100200bp第50页/共63页反应体系优化上机反应条件优化RT样品制备模板准备数据分析反应体积5ul，推荐2050ulMg2调节，酶活调节引物浓度优化，模板量优化退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定扩

24、增效率：90110重复性：std0.2标准曲线：R0.99或R2 0.98SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项标准品待测样本阳性对照阴性对照第51页/共63页技能要求误差控制仪器介绍上机试剂选择RT样品制备模板准备数据分析自配realmastermixRCHO-Lightcycler seriesROTOGEN-RG seriesBIO-RAD Opticon seriesABI-7seriesBioerLinegene series分装控制内参控制机器校正控制平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高SYBR法

25、实验流程及注意事项法实验流程及注意事项第52页/共63页 Rotor-gene6000 Rotor-gene6000 Rotor-gene6000 Rotor-gene6000 MiniOpticon MiniOpticon MiniOpticon MiniOpticon Mx3005PMx3005PMx3005PMx3005PTMTMTMTM LINE-GENE FQD-LINE-GENE FQD-LINE-GENE FQD-LINE-GENE FQD-66A66A66A66A ABI PRISM 7500ABI PRISM 7500ABI PRISM 7500ABI PRISM 7500

26、iQ5 Real-Time PCR Detection System iQ5 Real-Time PCR Detection System iQ5 Real-Time PCR Detection System iQ5 Real-Time PCR Detection System 第53页/共63页数据分析仪器介绍分析方法上机RT样品制备模板准备相对定量：2Ct法绝对定量：标准曲线法可靠，准确的数据可靠，准确的数据可靠，准确的数据可靠，准确的数据SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项第54页/共63页SYBR法理想实验结果梯度稀释扩增曲线梯度稀释扩增曲线第55页/共63页SYBR法理想

27、实验结果梯度稀释标准曲线Y=-3.37x+36.33;R2=0.992梯度稀释标准曲线第56页/共63页SYBR法理想实验结果熔解曲线梯度稀释熔解曲线第57页/共63页SYBR法理想实验结果样本扩增曲线JUNGAPDH第58页/共63页理想实验结果样本熔解曲线GAPDHJUN第59页/共63页TIANGEN公司荧光产品SYBR法探针法FP203 RealMasterMix(Probe)以DNA为模板FP202 RealMasterMix（SYBR Green）以RNA为模板FP302 Quant qRT-PCR(SYBR Green)FP303 Quant One Step qRT-PCR(SYBR Green)第60页/共63页TIANGEN公司荧光产品特点试剂盒中使用改良后的Hotmaster Taq Polymerase，具有高效率、高灵敏度、高特异性特点多种不同的实验缓冲液，满足不同实验需求高效的Quant系列逆转录酶，满足RT需求独特的Mg2自动调节，随时保证为PCR提供最佳 Mg2浓度第61页/共63页谢谢！第62页/共63页感谢您的观看！第63页/共63页