荧光性假单胞菌抗性基因筛选.pptx

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1、实验背景荧光假单胞菌可产生10 多种具有抗菌作用的 抗生性次级代谢产物 藤黄绿脓菌素【Plt】硝吡咯菌素【Prn】2，4-二乙酰基藤黄酚【Phl】生物表面活性剂（环脂肽【CLP】、鼠李糖脂）嗜铁素(水杨酸、绿脓杆菌螯铁蛋白、青脓素)卵菌素A 氢氰酸 邻氨基苯甲酸第1页/共15页随着生物工程技术的发展，从分子水平对藤黄绿脓菌素(Plt)、2，4-二乙酰基藤黄酚(Phl)、硝吡咯菌素(Prn)、环脂肽(CLP)等抗生性次级代谢产物的合成机制进行了深入研究，与其相关的功能基因已经被鉴定。本实验设计了针对特定基因的引物，利用PCR技术，筛选可以产生藤黄绿脓菌素(Plt)、2，4-二乙酰基藤黄酚(Phl

2、)、硝吡咯菌素(Prn)、环脂肽(CLP)的荧光性假单胞菌第2页/共15页实验流程一，实验准备1，配置LB培养基，灭菌2，96孔板清洗干净，包好 灭菌3，移液器枪头（1mL，200uL，10uL），0.2mL PCR管，1.5ml EP管，包好灭菌4，去离子水，灭菌第3页/共15页二，荧光性假单胞菌菌种的活化1，在96孔板的每个孔中加入540l LB培养基2，接入60l甘油菌注意：这一步要做好记录，记清楚每个孔中接入 的是那一株菌种注意：每一组学生接种一支阳性菌株Pf-53，将接过菌的96孔板置于28摇床过夜培养注意：96孔板需固定好，防止倾斜导致菌种 交叉污染第4页/共15页接种记录表格12

3、3456789101112APf-5BCDEFGH第5页/共15页三，菌落PCR所用引物a.环脂肽CLP:(1)PGPRB-4965/PGPRB-4966 (2)PGPRB-5045/PGPRB-5046b.2,4-乙酰藤黄酚Phl:Phl2a/Phl2bc.硝吡咯菌素Prn:Prnd1/Prnd2d.藤黄绿脓菌素Plt:PltC1/PltC2第6页/共15页三，菌落PCRPCR体系:20ul灭菌去离子水 15.2 ul10buffer 2 uldNTP 0.8 ul 上游引物 0.4 ul下游引物 0.4 ulTaq酶 0.2 ul模板 1 ul第7页/共15页以8个样品、1个阳性对照（Pf

4、-5）和1个阴性对照为例的MIX 10PCR H2O 15.2ul 152ul10buffer 2ul 20uldNTP 0.8ul 8ul上游引物 0.4ul 4ul下游引物 0.4ul 4ulTaq酶 0.2ul 2ul在EP管中加入试剂后，分装入10个PCR管中，19ul/管，其中1管作为阴性对照，1管作为阳性对照，加入1uLPf-5菌液作为模版，剩下8管分别加入1ul 模板 第8页/共15页菌落PCR实验流程根据各组所做的模板数目计算mix，依次加入除模板之外的各试剂后混匀，离心，分装19 uL入PCR管，对PCR管进行编号将活化好的菌液取100 uL按照编号从96孔板分别移到1.5m

5、L EP管中，盖紧盖子，置于沸水中煮10分钟。离心，各取1 uL作为模板加入PCR管中将PCR管放入设好程序的PCR仪中运行第9页/共15页四，琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果1，配置1%的琼脂糖凝胶 称取0.8 g琼脂糖，加入80mL 1xTAE缓冲液，置于电炉上煮沸3次，冷却至不烫手时加入40 uL的EB染料，摇匀，倒入胶板。放置梳子（注意选择足够孔数的梳子）。静置30-40 min待凝胶冷却。2，点样，电泳 将凝胶移入电泳槽，电泳槽中应该有充足的1x TAE缓冲液。PCR产物中加入2 uL 10 x上样缓冲液，混匀，离心。每孔依次点样4 uL，记录每孔点入的样品编号。每一块凝胶的一个孔需加入

6、4 uL Pf-5 PCR产物作为对照。120V 电泳30 min3，结果 凝胶成像记录电泳结果第10页/共15页1 2 1 2 1 2 MprnphlpltPrn：786 bpPhl：745 bpPlt：438 bp第11页/共15页。CLPPGPRB-4965/PGPRB-4966 360 bpPGPRB-5045/PGPRB-5046 960 bp第12页/共15页五，整理实验结果并进行菌种的保藏记录并整理PCR结果阳性的编号相应编号的菌株需进行保藏撰写实验报告，附实验结果记录表格 （每个小组撰写一份报告）第13页/共15页序号序号菌种编号菌种编号4965/49665045/5046phlprnplt1XXX+2XXX+实验结果记录表格第14页/共15页感谢您的观看！第15页/共15页