1.1DNA重组技术的基本工具45(PPT44页).ppt

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1、专题一专题一 基因工程基因工程假如你是一位假如你是一位育种专家育种专家，你能培育出下面几，你能培育出下面几种种“生物生物”吗？请问你准备用什么方法？吗？请问你准备用什么方法？这些定向改造基因的设想能实这些定向改造基因的设想能实现吗？现吗？经过多年的努力，科学家经过多年的努力，科学家终于终于在在2020世纪世纪7070年代创立了可以年代创立了可以定向改造定向改造生生物的新技术物的新技术 基因工程基因工程一一.基因工程的概念基因工程的概念基因工程基因工程的别名的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平特点特点本质本质DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水

2、平分子水平定向改造生物定向改造生物基因重组基因重组 基因工程是指基因工程是指按照人按照人们的愿望们的愿望，进行严格的，进行严格的设计，并通过设计，并通过体外体外DNADNA重重组和转基因等技术组和转基因等技术，赋，赋予生物以予生物以新的遗传特性新的遗传特性，从而创造出更符合人们从而创造出更符合人们需要的需要的新的生物类型和新的生物类型和生物产品生物产品。由于基因工。由于基因工程是在程是在DNADNA分子水平分子水平上进上进行设计和施工的。因此行设计和施工的。因此又叫做又叫做DNADNA重组技术。重组技术。1.1 DNA1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具三种基本工具三种基本工具剪

3、刀剪刀针线针线运输车运输车限制性核限制性核限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶酸内切酶酸内切酶DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶运载体运载体运载体运载体问题探讨：问题探讨：苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒蛋白毒蛋白毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简要过程的简要过程普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌（有抗虫性状）（有抗虫性状）提取提取抗虫基因抗虫基因棉花细胞棉花细胞(含抗虫基因含抗虫基因)棉花植株棉花植株(有抗虫特性有抗虫特性)重组重组DNADNA导入导入形成形成培育抗虫棉的关键步

4、骤有哪些？培育抗虫棉的关键步骤有哪些？基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与与DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因进入棉花细胞进入棉花细胞“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体主要来源：主要来源：（1）限制性核酸内切酶）限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”原核生物原核生物限制

5、酶限制酶就是细菌的一种就是细菌的一种防御性工具防御性工具，切割外源切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。、使之失效，从而达到保护自身的目的。简称：简称：限制酶限制酶分布：分布：主要在主要在原核生物原核生物中中你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？二二.基因工程的工具基因工程的工具原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNADNA的入侵的入侵，但生物在长期，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外的进化过程中形成了一

6、套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。来病原物的侵害。限制酶限制酶就是细菌的一种就是细菌的一种防御性工具防御性工具，当外源当外源DNADNA侵入时，会利用限制酶侵入时，会利用限制酶将外源将外源DNADNA切割掉切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到起到切割外源切割外源DNADNA、使之失效，从而达到保护自身的、使之失效，从而达到保护自身的目的目的。限制酶在原核生物中的作用限制酶在原核生物中的作用 T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 A2 2、作用特点：、作用特点：2、作用特点：、作用特点：识别识别识别识别特定核苷酸序

7、列特定核苷酸序列特定核苷酸序列特定核苷酸序列,切断两个切断两个切断两个切断两个核苷酸之间的核苷酸之间的核苷酸之间的核苷酸之间的磷酸二酯键。磷酸二酯键。磷酸二酯键。磷酸二酯键。具有具有特异性特异性。一种限制酶一般只能识别一种。一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割切割DNADNA分子。分子。（1）限制性核酸内切酶）限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”3 3、限制酶识别序列、限制酶识别序列大多数大多数大多数大多数限制酶的识别序列由限制酶的识别序列由限制酶的识别序列由限制酶的识别序列由6 6 6 6个个个个核苷酸组成核苷酸组成核

8、苷酸组成核苷酸组成少数的少数的少数的少数的识别序列由识别序列由识别序列由识别序列由4 4 4 4、5 5 5 5或或或或8 8 8 8个个个个核苷酸组成核苷酸组成核苷酸组成核苷酸组成思考与探究思考与探究 P7P72 2、为什么限制酶不剪切细菌本身的、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNADNA？通过长期的进化，含有某种限制通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其酶的细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备这不具备这种限制酶的识别切割序列种限制酶的识别切割序列，或者，或者通过通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。碱基上，使限制酶不能将

9、其切开。这这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的会使自身的DNADNA被切断，并且可以防止被切断，并且可以防止外源外源DNADNA的入侵。的入侵。限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6个碱基个碱基还是还是4个碱基，都可以找到一条个碱基，都可以找到一条中心轴线中心轴线（如图），中轴线两侧的双链（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基上的碱基是是反向、对称、重复反向、对称、重复排列的。排列的。想一想限制酶所识别的序列有什么特点？想一想限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列的特点限制酶所识别的序列的特点 中心轴线两侧的双链中心轴线两侧的

10、双链DNADNA上的碱基是上的碱基是反向对称反向对称重复排列的。重复排列的。EcoREcoREcoREcoRSmaSmaSmaSma3 3、限制性核酸内切酶的作用特点、限制性核酸内切酶的作用特点能识别特定核苷酸序列；能识别特定核苷酸序列；（专一性）（专一性）3 3、限制性核酸内切酶的作用特点：、限制性核酸内切酶的作用特点：从特定部位的两从特定部位的两个核苷酸之间切开。个核苷酸之间切开。（切点：切点：磷酸二酯键磷酸二酯键）T1234512345 A（专一性）（专一性）Sma平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端4.限制酶的作用结果：限制酶的作用结果：EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性

11、末端4.限制酶的作用结果：限制酶的作用结果：EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端重复演示重复演示重复演示重复演示EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端 大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶的一种限制酶EcoR能能识别识别GAATTC序列，并在序列，并在G和和A之间切开。之间切开。什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切两条单链的切口，带有几个口，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正，他们之间正好好互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。Sma平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端限制酶限制酶Sma

12、Sma能识别能识别GGGCCCGGGCCC序列，并在序列，并在G G和和C C之间切开。之间切开。平末端平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGEcoREcoRG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G GG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAAC

13、TTAACTTAAG G G G不同来源的不同来源的不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合片段混合片段混合将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的DNADNA片段连接起来片段连接起来片段连接起来片段连接起来生物生物生物生物A A基因片段基因片段基因片段基因片段生物生物生物生物B B基因片段基因片段基因片段基因片段G G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G GG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G G酶切酶切酶切酶切（1 1）限制性核酸内切酶）

14、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”4.4.作用结果：作用结果：产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性酶切几个切口？可产生几个黏性(平平)末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端末端，然后让两，然后让两者的黏性者的黏性(平平)末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合起来，就似乎可以合成重组的成重组

15、的DNA分子了。分子了。思考思考?（2 2）“分子缝合针分子缝合针”DNA DNA连接酶连接酶作用作用:把切下来的把切下来的把切下来的把切下来的DNADNA片段拼接成片段拼接成片段拼接成片段拼接成新的新的新的新的DNADNA，即将，即将，即将，即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来连接起来连接起来.作用原理：作用原理：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键 可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，EcoliEcoliDNADNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DNAD

16、NA连接酶连接酶连接酶连接酶即即即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶类型：类型：类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌

17、体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别（2 2）“分子缝合针分子缝合针”DNA DNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶寻根问底寻根问底 P6P6DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?AGTAC T AATDNA母链母链DNA聚聚合酶合酶DNADNA聚合酶聚合酶TTAG A TA TCCGAC

18、GGTTTAADNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同点相同点1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，将单个核苷酸通过磷酸将单个核苷酸通过磷酸将单个核苷酸通过磷酸将单个核苷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)能将能将DNADNA双链上的双链上的两个缺口同时连接两个缺口同时连接

19、起起来，来，不需要模板不需要模板【探规寻律】【探规寻律】几种酶的作用部位几种酶的作用部位限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、连接酶、DNA聚合聚合酶作用于酶作用于部位部位,DNA解旋酶作用于解旋酶作用于部位。部位。（3 3）“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体载体需要的条件：载体需要的条件：有有11多个限制酶切点多个限制酶切点对受体细胞无害对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选有某些标记基因，便于筛选常用运载体：常用运载体：质粒质粒 动植物病毒动植物病毒 （3 3）噬菌体的衍生物噬菌体

20、的衍生物 假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？（最常用）（最常用）质粒质粒是一种裸露的、结构简单、独是一种裸露的、结构简单、独立于立于细菌拟核细菌拟核DNADNA之外，并且有自我之外，并且有自我复制能力的复制能力的双链环状双链环状DNADNA分子。分子。常用的载体质粒：常用的载体质粒：能复制并带着能复制并带着能复制并带着能复制

21、并带着插入的目的基插入的目的基插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制因一起复制因一起复制有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的有标记基因的有标记基因的存在，可用含存在，可用含存在，可用含存在，可用含氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别独立于细菌拟核独立于细菌拟核独立于细菌拟核独立于细菌拟核DNADNA之外的一种可以自我之外的一种可以自我之外的一种可以自我之外的一种可以自我复制的复制的复制的复制的小型环状的小型环状的小型环状的小型环状的DNADNA分子分子分子分子1 1）载体载体载体载体DNADNA必需有必需有必

22、需有必需有一个或多个限制酶一个或多个限制酶一个或多个限制酶一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基的切割位点，以便目的基的切割位点，以便目的基的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是所处的位置，还必须是所处的位置，还必须是所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外在质粒本身需要的基因片段之外在质粒本身需要的基因片段之外在质粒本身需要的基因片段之外，这样，这样，这样，这样才不至

23、于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。2 2）载体载体载体载体DNADNA必需具备必需具备必需具备必需具备自我复制的能力自我复制的能力自我复制的能力自我复制的能力，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体DNADNA上随染色体上随染色体上随染色体上随染色体DNADNA的的的的复制而同步复制复制而同步复制复制而同步复制复制而同步复制。3 3）载体载体载体载体DNADNA必需必需必需必需带有标记基因带有标记基因带有标记基因带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。，以便重组后进

24、行重组子的筛选。，以便重组后进行重组子的筛选。，以便重组后进行重组子的筛选。4 4）载体载体载体载体DNADNA必需必需必需必需是安全的是安全的是安全的是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入，不会对受体细胞有害，或不能进入，不会对受体细胞有害，或不能进入，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5 5）载体载体载体载体DNADNA分子分子分子分子大小应适合大小应适合大小应适合大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太，以便提取和在体外进行操作，太，以便提取和在体外进行操

25、作，太，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒DNADNA分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。小结基因工程基因工程的工具的工具限制限制酶酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性(识别序列识别序列)切开切开DNA分子的磷酸二酯

26、键分子的磷酸二酯键产生黏末端或平末端产生黏末端或平末端DNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键种类种类E.coliDNA连接酶连接酶T4DNADNA连接酶连接酶运载运载工工具具具备的具备的条件条件能在宿主细胞中自我复制能在宿主细胞中自我复制并稳定存在并稳定存在具一种至多种限制酶切点具一种至多种限制酶切点具标记基因具标记基因质粒、质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒噬菌体衍生物、动植物病毒基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定1.限制酶在限制酶在DNA的任何部位都能将的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的种不同限制酶切割形成的DNA片段片段:你是否能用你是否能用DNA连接连接酶将它们连接起来？酶将它们连接起来？CTGCAGACTGCGGCGCTTAAGACGTCGCCGGTCAAATTCG和和能连接形成能连接形成ACTGGTCA和和能连接形成能连接形成GCTTAAAATTCGCGGCGCCG和和能连接形成能连接形成和和能连接形成能连接形成CTGCAGGACGTC反反向向对对称称思考与探究思考与探究 P7P7