选修三11DNA重组技术的基本工具.pptx

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1、定向基因改造设想 设想一设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌能否让细菌能否让细菌能否让细菌“吐出吐出吐出吐出”蚕丝？蚕丝？蚕丝？蚕丝？设想二设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？贵的药物？贵的药物？贵的药物？设想三设想三经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程。基因工程，又叫DNA重

2、组技术。是指按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。什么是基因工程什么是基因工程?一、基因工程的概念一、基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作环境操作环境操作对象操作对象操作对象操作对象操作水平操作水平操作水平操作水平基本过程基本过程基本过程基本过程实质实质实质实质(原理原理)结果结果结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNADNADNA重组技术重组技术重组技术重组技术生物体外生物体外生物体外

3、生物体外基因基因基因基因DNADNADNADNA分子水平分子水平分子水平分子水平人类需要的基因产物人类需要的基因产物人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切剪切剪切 拼接拼接拼接拼接 导入导入导入导入 表达表达表达表达基因重组基因重组基因重组基因重组优点：定向改造生物性状定向改造生物性状 克服远缘杂交不亲和的障碍克服远缘杂交不亲和的障碍 育种周期短育种周期短1、DNA是遗传物质。是遗传物质。2、DNA的双螺旋结构的双螺旋结构3、中心法则的提出、中心法则的提出4、遗传密码的破译、遗传密码的破译二、基因工程的诞生二、基因工程的诞生（一）理论基础：（一）理论基础：1)基因转移载体质粒的发现2)多

4、种限制酶、连接酶，以及逆转录酶（工具酶）的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明（二）技术发明：（二）技术发明：三、基因工程的原理1、不同生物DNA分子得以重新拼接的基础（1）DNA分子的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。（2）DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。（3）所有DNA 碱基互补配对方式相同。2、外源DNA在受体内表达的基础（1）基因是控制生物性状的基本单位，具有相对独立性。（2）遗传信息的传递都遵循中心法则。（3）生物界共用一套遗传密码。基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤

5、或难点是什么？普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性关键步骤一：关键步骤一：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来提取出来提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNA连接连接连接连接关键步骤三：关键步骤三：关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因抗虫基因抗虫基因导入受体导入受体导入受体导入受体(棉花棉花

6、棉花棉花)细胞细胞细胞细胞剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来抗虫基因与棉花DNA“缝合”抗虫基因进入棉花细胞“分子手术刀”限制性核酸内切酶“分子缝合针”DNA连接酶“分子运输车”基因进入受体细胞的载体关键步骤二：关键步骤三：DNA重组技术的基本工具限制性核酸内切酶“分子手术刀”来源：主要从原核生物中分离纯化出来。种类：已从近300种微生物中分离出4000种限制酶。作用：1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。作用特点：具有特异性（专一性）。一种限制

7、酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，限制酶的识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成作用结果形成两种末端：形成两种末端：黏性末端或平末端黏性末端或平末端12345脱氧核苷酸的结构脱氧核苷酸的结构 G1234512345 A3,5-3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键3端5端3端5端 一个核苷酸核糖上第3位的羟基与下一个核苷酸核糖上第5位的磷酸羟基脱水缩合成酯键，该酯键称又3,5磷酸二酯键。磷酸二酯键：磷酸二酯键：磷酸二酯键：即脱氧核糖、即脱氧核糖、磷酸之间的磷酸之间的连接连接仔细观察各限制酶识别仔细观察各限制酶识别的特定序

8、列有何特点？的特定序列有何特点？限制酶的识别序列限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特限制酶所识别的序列的特点是：点是：呈现呈现碱基互补对称碱基互补对称，无论是无论是6 6个碱基还是个碱基还是4 4个碱个碱基，都可以找到一条中心基，都可以找到一条中心轴线，轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向重复的。黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割 大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。中轴线中轴线CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG 练习使用练习使用EcoRI E

9、coRI 剪切剪切目的基因目的基因CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG 目的基因目的基因Sma平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线中轴线平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，从识别序列的中心轴线处切开时，切开的切开的DNADNA两两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。限制酶的作用结果：产生黏性末端或平末端。你

10、能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？P4原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。课后习题：为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?主要切割外源主要切割外源 DNA，而对自身的，而对自身的 DNA 不起不起作用，达到保护自身的目的。原因作用，达到保护自身的目的。原因是原核生物中是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。不存在该酶的

11、识别序列或识别序列已经被修饰。要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。1.下列关于限制酶的说法正确的是A限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少B一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C不同的限制酶切割 DNA 后都会形成黏性末端D限制酶的作用部位是特定的核苷酸形成的氢键B2.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的 DNA 片断时，需使用A同种限制酶 B两种限制

12、酶C同种 DNA 连接酶 D两种 DNA 连接酶A3.下列四条下列四条DNA片段，可能是由同一种限制酶切割而成的是片段，可能是由同一种限制酶切割而成的是ABC DDDNADNA连接酶连接酶连接酶的作用连接酶的作用：将将互补配对的两互补配对的两个黏性末端个黏性末端或或平末端平末端连接起来，连接起来，使之成为一个完整的使之成为一个完整的DNADNA分子。分子。基因进行了切割以后就有了切口，基因进行了切割以后就有了切口，怎怎样才能将有切口的基因与其他基因缝合样才能将有切口的基因与其他基因缝合在一起呢？在一起呢？积极思考（二）（二）DNA连接酶连接酶 分子缝合针分子缝合针磷酸二酯键磷酸二酯键G A A

13、 T T C C T T A A G GP AP 把两条双链把两条双链DNADNA片段片段之间的缝隙之间的缝隙“缝合缝合”起来。起来。即将脱氧核糖和磷酸连接起来.要实现目的基因与载体的连接则在对其切割时应选用要实现目的基因与载体的连接则在对其切割时应选用 限制酶。限制酶。1 1、作用：、作用：作用原理催化磷酸二酯键形成 2 2、作用部位：、作用部位：3 3、分类、分类Ecoli DNAEcoli DNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：同一种 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端可把黏

14、性末端可把黏性末端之间的缝隙之间的缝隙之间的缝隙之间的缝隙“缝合缝合缝合缝合”起起起起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的组的组的组的DNADNA分子就形成了。分子就形成了。分子就形成了。分子就形成了。类型来源功能相同点差别EcoliDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)作用作用应用应用限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶DNA连接酶连接酶DNA连接酶与限制酶的比较

15、 (1)区别：(2)两者的关系可表示为：两者的关系可表示为：使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接两两DNADNA片段要具有片段要具有互补互补的黏性末端的黏性末端才能拼起来才能拼起来DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来起来，注意：注意：DNADNA连接酶可连接双链连接酶可连接双链DNADNA中的中的DNADNA单链缺口，单链缺口，但但不能连接单链不能连接单链DNADNA！Ecoli DNAEcoli DNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DNA

16、DNA连接酶连接酶连接酶连接酶可把可把黏性末端黏性末端之间的之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来起来，即恢复被限制酶切开即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键的两个核苷酸之间的磷酸二酯键由于氢键是分子间作用力，其断裂与重新形成均以限制酶和由于氢键是分子间作用力，其断裂与重新形成均以限制酶和DNA连接酶无关。连接酶无关。DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？T4 DNA连接酶还可把平末端平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用A A T T GA A T T GC CA AA AT TT TA AA AT TT

17、TDNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的作用聚合酶的作用DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象 作用结果作用结果用途用途都能催化都能催化两个核苷酸之间两个核苷酸之间形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键都是蛋白质，但组成和性质不同都是蛋白质，但组成和性质不同不需要不需要需要需要形成形成DNA的一条链的一条链基因工程基因工程DNA复制复制DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶的比较聚合酶的比较在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键(用于基因工程操作)将单个核苷

18、酸加到已存在的DNA片段的 3端的羟基上，形成磷酸二酯键(用于 DNA 的复制)将存在的 DNA 片段连接成完整重组 DNA 分子限制性内切酶限制性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切，限制性内切酶酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶。在质粒上有酶的一个切的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。的切点。（1）请画出质粒被限制酶）请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶）请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。（3）

19、在）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？性末端能否连接？为什么？可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）（或是可以互补的）（三）基因进入受体细胞的载体（三）基因进入受体细胞的载体 分子运输车分子运输车 具备哪些条件才能充当具备哪些条件才能充当“分子运输车分子运输车”？A A、具有多个、具有多个限制酶切割位点限制酶切割位点，以便外源基因插入其中；，以便外源基因插入其中；B B、具有特殊的、具有特殊的标记基因标记基因，

20、便于鉴定和选择。，便于鉴定和选择。C C、能够在宿主细胞中、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存复制并稳定地保存；D D、对受体细胞、对受体细胞无害无害2 2、载体的作用、载体的作用1、载体必须具备的条件：3 3、种类：、种类：将外源基因送入受体细胞。质粒、质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒等噬菌体衍生物、动植物病毒等E E、载体、载体DNADNA分子大小应适合分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作太大就不便操作.在受体细胞内对目的基因进行在受体细胞内对目的基因进行在受体细胞内对目的基因进行在受体细胞内对目的基因进行大量复制大量复制大量复制大量复制有有标记基因

21、标记基因的存的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培养基鉴别。素的培养基鉴别。有有切割位点切割位点能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制质粒质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNADNA）之外，并具有）之外，并具有自我复制能力自我复制能力的很小的的很小的双链环状双链环状DNADNA分子。分子。最常用运载体最常用运载体质粒质粒 实际上实际上在基因在基因工程操作中，工程操作中，真正被用作载真正被用作载体的质粒，并体的质粒，并不具备所有条不具备所有条件，都是在天件，都是在天然质粒的基础然质粒的基础上进行过人工上进行

22、过人工改造的。改造的。小结小结基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性(识别序列识别序列)切开切开DNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键DNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键 种类种类E.coliDNA连接酶连接酶T4 DNADNA连接酶连接酶运载运载工工 具具具备的具备的条件条件结构简单结构简单,大小适中大小适中能在宿主细胞中自能在宿主细胞中自我复制并稳定存在我复制并稳定存在具一个或多个限制酶切位点具一个或多个限制酶切位点具标记基因具标记基因对受体细胞无害对受体细胞无害质粒、质粒、噬菌体衍生物噬菌体衍生物、动植物病毒、动植物

23、病毒 项目 种类作用底物作用部位作用结果限制酶DNA 连接酶DNA 聚合酶DNA(水解)酶DNA 解旋酶几种酶的比较：DNA 分子磷酸二酯键形成黏性末端或平末端DNA 分子片段磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键DNA 分子DNA 分子脱氧核苷酸形成重组 DNA 分子形成子代DNA 分子形成脱氧核苷酸形成单链 DNA 分子碱基对间的氢键(1)(1)不同不同DNADNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNADNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(2)(2)不同限制酶切割形

24、成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对。不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对。四种酶的作用部位图解四种酶的作用部位图解(1)作用于作用于a(磷酸二酯键磷酸二酯键)的酶有：的酶有：(2)作用于作用于b(氢键氢键)的酶是的酶是:限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶。解旋酶。(1)DNA(1)DNA连接酶的作用不是连接互补的碱基之间的氢键，而是脱氧核连接酶的作用不是连接互补的碱基之间的氢键，而是脱氧核糖和磷酸间的磷酸二酯键。糖和磷酸间的磷酸二酯键。(2)(2)限制酶切割一次，会产生限制酶切割一次，会产生2 2个黏性末端或平末端，水解个黏性末端或平末端，水解2 2个磷酸个磷酸二酯键

25、。二酯键。(3)(3)限制酶的作用并非只是切取目的基因，还用于切割载体。限制酶的作用并非只是切取目的基因，还用于切割载体。1.下列关于 DNA 连接酶的叙述中，正确的是催化相同黏性末端的 DNA 片段之间的连接催化不同黏性末端的 DNA 片段之间的连接催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成催化 DNA 分子两条链的脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键的形成ABCDD2.下列哪项不是基因工程中经常使用的“分子运输车”A细菌质粒 B噬菌体的衍生物C动植物病毒 D细菌核区的 DNAD3.下列关于基因工程中所选用的质粒的说法，错误的是A不能没有标记基因 B是小型链状的 DNA 分子C能够自我复制 D可与目的基

26、因重组B4.下图为下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作连接酶、解旋酶作用的正确顺序是用的正确顺序是 ()A B C D本题考查不同工具酶的作用及作用特点。图示中表示该酶切割DNA分子双链产生黏性末端的过程，用到的酶是限制性核酸内切酶；是黏性末端连接的过程，用到的酶是DNA连接酶；是DNA分子解旋的过程，要用解旋酶；是DNA复制过程，需要DNA聚合酶。C5.下面是四种不同质粒的示意图，其中下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，为复制

27、必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性核酸内切酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素一种限制性核酸内切酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是的细胞，应选用的质粒是 ()A项破坏了复制必需的序列，不能复制。B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏。C