赵静 食品微生物.pptx

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1、引言材料和方法结果与讨论结论第1页/共23页引言 海藻糖是一种非还原性，非常稳定的包含由a，a-1，1-葡萄糖苷键链接的两个a-葡萄糖单位的二聚糖。海藻糖有温和的甜味，高溶解度和低吸湿性。在一些食品加工和储存中它也很稳定，从而能防止美拉德反应；因此，它被应用于干燥食品（奶粉，果汁），冷冻食品，糖果（蛋糕，烤糖果，果酱，奶油，甜果酱），饮料，发酵食品（面包，酸奶），冰淇淋，酱油，甜味剂和调味品。海藻糖结构式：第2页/共23页 它也可以在食用的食物中用来作为食品添加剂。海藻糖也被报告还有保健品价值。它的甜度为蔗糖的一半，提供持续的能量。另据报道海藻糖在乳酸乳球菌中作为压力保护剂起作用。如果海藻糖能

2、够实现经济化，它在食品领域和其他领域中的新兴应用也能够实现。用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生产海藻糖的常规方法具有相对低的产量，已经被酶转化过程取代。与酶的方法相比，各种微生物为基础的过程在利用农业或工业的废弃物为底物用于生产有价值的代谢产物具有优势。因此，利用像粗甘油的生物柴油废物，微生物替代目前使用酶法工艺生产海藻糖滴度较高，在经济上和环境保护方面有优势。生物柴油制造行业生产的大量的生物柴油废物带来了主要的环境风险。同样，粗甘油通过微生物转化成增值产品是对废弃物的另一种利用，这似乎是在经济上更可行。第3页/共23页 丙酸杆菌是革兰氏阳性，非芽胞，不能运动的多

3、形性杆菌。它们在30和中性pH值条件下生长最佳。众所周知的是它具有多种益生菌特性，被视为安全的食品微生物。丙酸杆菌被称为是厌氧的，但据报道，他们对有氧条件也不是很敏感。另据报道，费氏丙酸杆菌在有氧条件下生长会导致生物量的增加和有机酸的形成物曲线的变化。在本研究中，其中费氏丙酸杆菌亚种.薛氏（Propionibacterium freudenreichii subsp.Shermanii）NCIM5137的渗透敏感突变体和亲本株用纯甘油和粗甘油作为碳源在有氧条件下进行培养(在摇瓶中以200rpm转速和生物反应器中30空气饱和度)海藻糖含量和生物量增长曲线在固定的时间间隔内被测定。丙酸和乳酸等有机

4、酸的最终产率也被估计。第4页/共23页材料和方法微生物和培养基成分突变体的化学诱变，筛选和分离摇瓶实验批式反应器实验粗甘油或着制备及预处理生物柴油废物海藻糖的提取和分析 有机酸的HPLC分析生物量定量底物分析 第5页/共23页结果与讨论 1）在P.shermanii NCIM5137摇瓶实验中利用纯甘油和粗甘油生产海藻糖 图1用P.shermanii NCIM5137在纯甘油和粗甘油介质中的生物量的产量和海藻糖滴度(Fig.1 Trehalose titre and biomass production in media with pure and crude glycerol in P.sh

5、ermanii NCIM 5137)（在摇瓶培养条件下，有氧条件下）第6页/共23页因此，本研究表明，在有氧条件下，有利于细胞的生长，这导致海藻糖相对于生物量，有一个较低的产量。因此，可以得出结论，尽管海藻糖相对于生物量的产量(YTx)减少了两倍（表3），但是在有氧的条件下导致最终的生物量浓度高20倍，整体海藻糖滴定度增加2.3倍（表1）。不幸的是，获得的海藻糖滴度并不理想，因此努力在有氧条件下使用已开发的渗透敏感的突变体，以提高海藻糖的滴度。表1在用P.shermanii亲本株条件下比较用纯甘油与粗甘油得到的的海藻糖滴度，丙酸和乳酸酸产量(Table 1 Comparison of treh

6、alose titre and propionic acid and lactic acid yields in parent strain of P.shermanii with pure and crude glycerol)海藻糖滴度：粗甘油为2.3倍纯甘油第7页/共23页2）利用渗透敏感突变体P.shermanii NCIM513在摇瓶中使用纯甘油和粗甘油生产海藻糖 图2用P.shermanii NCIM5137渗透敏感突变体在纯甘油和粗甘油介质中的生物量的产量和海藻糖滴度 Fig.2 Trehalose titre and biomass growth in media with p

7、ure and crude glycerol in osmotically sensitive mutant of P.shermanii NCIM 5137（在摇瓶培养条件下，有氧条件下）第8页/共23页因此，在类似的实验条件下用粗甘油得到的海藻糖的滴度，突变株与亲本株相比高3.6倍。表2在用P.shermanii渗透敏感突变株条件下比较用纯甘油与粗甘油得到的的海藻糖滴度，丙酸和乳酸酸产量 Table 2 Comparison of trehalose titre and propionic acid and lactic acid yields in mutant strain of P.

8、shermanii with pure and crude glycerol 亲本株为361 11mg/l(表1)突变株为130322 mg/l(表2)第9页/共23页因此，利用突变体用粗甘油介质可以得出在摇瓶条件下比在静态烧瓶中海藻糖相对于生物量的产量（Ytx）下降了1.74倍的结论（表3)。生物量浓度利用突变体在有氧培养条件下增加了25倍，海藻糖滴度增加了3.6倍。因此，我们要采取措施在不影响海藻糖相对于底物消耗的产量(Yts)的条件下以确保较高的海藻糖滴度提高3.6倍。这些结果促使我们用粗甘油在控制式批式反应器中研究海藻糖的生产。表3 P.shermanii NCIM5137的突变株和亲

9、本株用粗甘油（20克/升）在需氧和厌氧条件下），比较海藻糖相对于生物量的产量（Ytx），海藻糖相对于底物消耗（Yts）和海藻糖滴定度（全部海藻糖）Table 3 Comparison of trehalose yield with respect to biomass(Ytx)and substrate consumed(Yts),trehalose titre(absolute trehalose)in mutant and parent strain of P.shermanii NCIM 5137 with crude glycerol(20 g/l)in aerobic and ana

10、erobic conditions（在静态烧瓶中是厌氧状态，在摇瓶中是有氧状态）大约是4倍大约是4倍第10页/共23页3）利用渗透敏感突变体P.shermanii NCIM5137在批式反应器中研究实现较高的海藻糖滴度 图3(在批式反应器条件下利用粗甘油介质和P.shermanii NCIM5137的渗透敏感突变，海藻糖滴度和增加的生物量)Fig.3 Trehalose titre and biomass growth in media with crude glycerol in osmotically sensitive mutant of P.shermanii NCIM 5137 un

11、der batch reactor conditions第11页/共23页结论 本研究中描述了一种新颖的方法，使用食品微生物Propionibacterium freudenreichii subsp.Shermanii的渗透敏感突变体把生物柴油废物中的粗甘油转化为保健产品海藻糖。海藻糖滴度从158毫克/升提高到1.56克/升，前者利用亲本株使用纯甘油在摇瓶培养中，后者利用突变株使用粗甘油在批式反应器条件下。因此，利用废物在安全的食品微生物的帮助下，一个高效，不破坏环境的海藻糖的生产工艺被开发。通过有氧培养条件改善海藻糖滴度的方法似乎是有效的，它可以实现更高生产率并可以得到进一步研究。在相似的

12、实验条件下，海藻糖相对于生物量的产量(Yt x)使用突变体与使用亲本株相比高出四倍(表3)。产量的明显提高，导致了海藻糖滴度使用突变株比使用亲本株高出四倍。摇瓶培养中，用粗甘油介质，得到的海藻糖滴度：亲本株361mg/l；突变株1.3g/l第12页/共23页谢谢！第13页/共23页 微生物和培养基成分 菌株和培养基和以前描述的那些是相同的。薛氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)NCIM5137取自于NCL Pune,India。对于海藻糖的生产，使用的培养基与其他地方报道的是相同，包括胰蛋白胨（20克/升），蛋白胨（20克/升），酵母提取物（1克/升）

13、，磷酸氢二钾（0.25克/升），维生素溶液（20毫升/升）和碳源（20克/升）。维生素溶液包括生物素（1.1毫克/升），叶酸（1.1毫克/升），对氨基苯甲酸（110毫克/分升），核黄素（110毫克/分升），吡哆醇（220毫克/升），硫胺素（220毫克/升）和烟酰胺（220毫克/升）。第14页/共23页 突变体的化学诱变，筛选和分离 渗透敏感突变体的分离和筛选之前被报道过。简言之，25毫升液体培养基是指数增长阶段的P.Shermanii NCIM 5137。离心分离沉淀得到的细菌细胞悬浮在5 mM磷酸盐缓冲液的pH值为7.1。8EMS溶于5mM磷酸盐缓冲液（pH7）对其进行化学诱变。细菌细胞悬浮

14、在8 EMS的溶液中，并在37 下培养45分钟，之后将细胞沉淀用硫代硫酸钠洗涤三次，抵销诱变剂的效果。进一步不同稀释度的细菌细胞（10-1-10-8）在以葡萄糖作为碳源琼脂平板上培养。从琼脂平板上进一步选择单菌落，接种单菌落的琼脂平板包含葡萄糖作为碳源，1，2，3，4和8 的NaCl，0.01和0.05 SDS和没有SDS和NaCl的琼脂平板。在NaCl板和SDS板上的菌落没有增长或微弱增长，被选择生产海藻糖。单菌落同时涂布含有0和3 NaCl的琼脂平板上的反复检查其稳定性。经过约50反复涂布，在本研究中任何菌落无法在3 氯化钠生长，但能够在0的NaCl生长。因此，突变体关于渗透敏感性得到证明

15、。第15页/共23页 摇瓶实验 培养物包含100毫升的液体介质放于500ml培养瓶中。全部培养瓶接种新鲜的培养基和菌落并在30，200 rpm条件下培养。通过分光光度法测量光密度监测生长。培养液的光密度测量是培养液20,000g，4下离心分离10分钟，所得沉淀被洗涤并重新悬浮在等渗溶液（0.85NaCl）中，然后在600 nm条件下通过光密度测量。而且，在一定时间间隔内收集细胞培养样品，并迅速在20,000g，4下离心15分钟;上清液（无细胞肉汤）被储存在-20条件下，被用于底物浓度的分析，然而洗涤后的细胞沉淀物储存在冰箱（-80），用于进一步分析海藻糖含量。第16页/共23页 批式反应器实验

16、 2-L的新的不伦瑞克（Brunswick，德国东部城市）高温高压灭菌发酵罐被用于所有批式反应的实验，静态烧瓶中的100毫升菌种经过24小时的增殖被用作接种物。高压灭菌后发酵罐分别加入介质，灭过菌的碳源，接种物最后加入。最后容积为2升，pH值通过自动添加NaOH保持在6.8和溶解的氧通过自动增加搅拌保持30的空气饱和度。样品在固定间隔（4-6小时）被采集，分别用于底物和产物的分析。第17页/共23页 粗甘油或制备及预处理生物柴油废物 为了评估粗甘油是否适合生产海藻糖和丙酸，生物柴油废物被用，生物柴油废物是使用豆油通过酯交换催化反应而制成的。粗甘油的合成物以前也被报道过。粗甘油与蒸馏水按照1:4

17、的比例（体积/体积）混合，以降低流体的粘度，然后用盐酸将流体的pH值调至3，转换成游离脂肪酸。粗甘油溶液经离心作用分离所形成的沉淀物为5000g，其后上清液的pH值用碱（KOH）调至12，紧接着再通过离心作用分离所形成的沉淀物。经过第二次离心后最后得到的上清液的pH值调节至6.8.在高压灭菌过程中甲醇会被除去。第18页/共23页 海藻糖的提取和分析 海藻糖的提取按照以前所报告那样进行。对于细胞内海藻糖，洗涤后的细胞沉淀悬浮于2毫升的80乙醇中，并在水浴中煮沸直到体积减少到0.20.3毫升。柠檬酸盐缓冲液（pH5.5，0.1M）加入该提取物中，使最终体积为1毫升，离心分离后的上层清液用于海藻糖的

18、定量分析。正如以前报道的那样 通过酶催化海藻糖的方法（Sigma-Aldrich公司）测定细胞提取液中的海藻糖的浓度。然后100ul的0.012 U的酶溶液中加入200ul细胞提取物，而对于对照溶液中加入100ul缓冲液代替酶。反应混合物保持在37 摇床中过夜（约12小时）。已知浓度的标准海藻糖（0.5克/升）也被培养，还分别与培养的样品对比，以确认海藻糖被海藻糖酶完全水解。水解后形成的葡萄糖由DNS方法进行定量。第19页/共23页 有机酸的HPLC分析 HPLC在260 nm波长条件下使用一个PL-HI-Plex的H柱和紫外可见检测器对乳酸和丙酸进行测定。所用的流动相为5mM的H2SO4，流速为1ml/min。使用纯丙酸和乳酸获得标准的曲线图对丙酸，乳酸的浓度进行测定。第20页/共23页 生物量定量 按照以前所报告那样生物量进行定量。在固定的时间间隔中收集的样品12,000g，4条件下进行离心，水洗收集的颗粒悬浮在生理盐水溶液中，接着将悬浮液在600nm处进行光密度测量。干重（细胞生物量）计算来自于一个标准点，标准点位于不同稀释度的细胞悬浮液的干重和光密度（OD）之间。第21页/共23页 底物分析 如以前所报告的，甘油通过高碘酸的方法测量。从已知的甘油浓度的校准曲线中估计甘油的浓度。第22页/共23页感谢您的观看！第23页/共23页