重组DNA技术操作过程.pptx

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1、3 3 重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程切切接接转转增增检检第1页/共65页A DNA的体外重组（切与接）3 3 重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程同种内切酶生产的粘性末端的连接同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接重组率重组率基于同源重组的基于同源重组的In-FusionIn-Fusion连接连接第2页/共65页同种内切酶生产的粘性末端的连接同种内切酶生产的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5G

2、CTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG第3页/共65页同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火GCCTAGGATCCG5 T

3、ACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIBclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT第4页/共65页不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA ligaseT4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CT

4、GCAGGACGTC5 PstIPstI3 T4-DNA polT4-DNA pol切平切平5 CG5 GCKlenowKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC第5页/共65页人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 55突出末端突出末端5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DNA ligase5 5KlenowKlenow补平补平KlenowKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTA

5、AGTdTTdTTdTTdTdGTPdGTPdCTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火退火BamH IBamH IBamH IBamH IEcoR IEcoR IBamH IBamH I第6页/共65页人工粘性末端的连接人工粘性末

6、端的连接 33突出末端突出末端CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火Pst IPst IPst IPst IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5G

7、CATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenowPst IPst ISph ISph I第7页/共65页人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 平头末端平头末端C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTdTTdTTdTTdTdTTPdTTPdATPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火C3 TTTTTTTTTTG

8、CAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1S1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT第8页/共65页基于同源重组的基于同源重组的In-FusionIn-Fusion连接连接载体质粒载体质粒重组质粒重组质粒每条引物外侧设计含有与载体相应末端同源的每条引物外侧设计含有与载体相应末端同源的15

9、15个碱基序列个碱基序列引物引物引物引物In-FusionIn-Fusion酶酶加入加入In-FusionIn-Fusion酶酶373715 min+5015 min+5015 min 15 min PCRPCR扩增扩增转化转化第9页/共65页重组率重组率重组率的定义重组率的定义 重组率重组率=含有外源含有外源DNADNA的重组分子数的重组分子数/载体分子总数载体分子总数；在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25-75%25-75%；重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化大大简化DNADNA重组

10、的后续操作。重组的后续操作。第10页/共65页重组率重组率提高重组率的方法提高重组率的方法提高外源提高外源DNADNA片段与载体的分子比片段与载体的分子比：5 5:1 1-10 10:1 1 载体载体DNADNA分子在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸基团：5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯

11、酶第11页/共65页重组率重组率提高重组率的方法提高重组率的方法加装同聚尾末端：加装同聚尾末端：CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火C3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG

12、CATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenow第12页/共65页B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增）3 3 重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程转化的原理与技术转化的原理与技术转化率转化率转化细胞的扩增转化细胞的扩增第13页/共65页转化的原理与技术转化的原理与技术CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化 Ca Ca2+2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），19701970年建立此技术，其原理是年建立此技术，其原理是CaCa2+2+与细菌外膜磷脂在低温下

13、形成液晶结构，后者经热脉与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。第14页/共65页转化的原理与技术转化的原理与技术CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的制备：的制备：100 100 ml ml 菌体培养至菌体培养至ODOD600 600=0.5=0.5，离心收集菌体；离心收集菌体；用用10 10 ml ml 冰冷的冰冷的10 10 mMmM CaClCaCl22溶液悬浮菌体，离心溶液悬浮菌体，离心用

14、用1 1 ml ml 冰冷的冰冷的75 75 mMmM CaClCaCl22溶液悬浮菌体；溶液悬浮菌体；冰浴放置冰浴放置12-2412-24小时，备用。小时，备用。收集菌体；收集菌体；第15页/共65页转化的原理与技术转化的原理与技术CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：的质粒转化：取取100 100 mml l 感受态细胞，加入相当于感受态细胞，加入相当于50 50 ng ng 载体的重组载体的重组冰浴放置半小时；冰浴放置半小时；在在4242保温保温 2 2 分钟（热脉冲）；分钟（热脉冲）；快速将转化细胞转移至冰浴中放

15、置快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-21-2分钟；分钟；DNADNA连接液，混匀；连接液，混匀；加入加入1 1 ml ml 新鲜培养基，新鲜培养基，于于3737培养培养 1 1 小时（扩增）；小时（扩增）；涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。第16页/共65页转化的原理与技术转化的原理与技术细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNADNA的主要屏障是细胞壁，的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用因而这类细菌通常采用原生质体原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移

16、质粒或重组（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNADNA分子。分子。酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化。原生质体法进行转化。第17页/共65页转化的原理与技术转化的原理与技术细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如养基中（如34%34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在在制备过程中，菌体应始终

17、悬浮在10.3%10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。有器皿应保持无水无去污剂。细菌原生质体细菌原生质体的制备：的制备：第18页/共65页转化的原理与技术转化的原理与技术细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化 取取0.2-10.2-1mlml的原生质体悬浮液（的原生质体悬浮液（10108 88 8-10-109 99 9个原生质体），加入个原生质体），加入10-20 10-20 mml DNAl DNA重重组连接液，同时加入含有组连接液，同时加入含有P E G 1 0 0 0P E G 1 0 0 0和和CaCa2+2+细菌原

18、生质体细菌原生质体的转化：的转化：细菌原生质体细菌原生质体的再生的再生：原 生 质 体 再 生 的 主 要 目 的 是 使 细 菌 重 新 长 出 细 胞 壁。再 生原 生 质 体 再 生 的 主 要 目 的 是 使 细 菌 重 新 长 出 细 胞 壁。再 生的等渗溶液，混匀。的等渗溶液，混匀。在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。第19页/共65页转化的原理与技术转化的原理与技术l l噬菌体噬菌体DNADNA的转染的转染感受态细胞的培养：感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和Mg

19、ClMgCl22的培养基中培养至的培养基中培养至ODOD600 600=0.5=0.5；吸附：吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，3030保温保温1010分钟；分钟；转染裂解：转染裂解：加入加入2020倍体积的新鲜培养基，倍体积的新鲜培养基，3030培养培养22小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。增加，然后涂板筛选。第20页/共65页转化的原理与技术转化的原理与技术电击转化电击转化 将将待待转转化化的的质质粒粒或或DNADNA重重组组连连接接液液滴滴加加在在电电穿穿孔孔转转化化仪仪的的样样

20、品品池池中中，两两极极施施加加高高压压电电场场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNADNA重组分子便可进入细胞内。重组分子便可进入细胞内。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。差别很大。同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。第21页/共65页转化率转化率转化率的定义转化率的定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体转化率是衡量转化效率

21、的重要指标，其定义为：每微克载体DNADNA在最佳转化条件下进入在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNADNA转化后，受体细胞接纳转化后，受体细胞接纳DNADNA的个数，的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。第22页/共65页转化率转化率转化率的定义转化率的定义 例例如如，pUC18

22、pUC18对对大大肠肠杆杆菌菌的的转转化化率率为为101088，即即每每微微克克pUC18pUC18中中只只有有101088个个分分子子能能进进入入受受体体细细胞胞。一一微微克克pUC18pUC18共共有有3.43.4X10X101111个个分分子子（6.026.02X10X1017 17/2686X6602686X660），也也就就是是说说，每每34003400个个pUC18pUC18分子才有分子才有一一个分子进入受体细胞。个分子进入受体细胞。另另一一方方面面，在在实实际际操操作作过过程程中中，转转化化一一微微克克pUC18pUC18共共需需22mlml感感受受态态细细胞胞，大大约约含含有有

23、22X10X101010个大肠杆菌细胞，也就是说，每个大肠杆菌细胞，也就是说，每200200个细胞只有一个细胞能接纳个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNApUC18 DNA。第23页/共65页转化率转化率 转化率的用途转化率的用途 利 用 转 化 率 和 重 组 率 等 参 数 可 以 帮 助 设 计利 用 转 化 率 和 重 组 率 等 参 数 可 以 帮 助 设 计D N AD N A重 组 实 验 规 模。重 组 实 验 规 模。例例如，如，某 一某 一D N AD N A重 组 实 验 的 重 组 率 为重 组 实 验 的 重 组 率 为2 0%2 0%，转 化 率 为，转 化 率

24、 为1 01 077/mmgg载 体，经 切载 体，经 切接 处 理 后 的 载 体 转 化 率 一 般 要 比 天 然 的 载 体 低接 处 理 后 的 载 体 转 化 率 一 般 要 比 天 然 的 载 体 低1 0 01 0 0倍。欲 获 得倍。欲 获 得1 01 04 44 4个 重个 重组克隆，需投入多少载体组克隆，需投入多少载体DNADNA进行重组实验？进行重组实验？若重组率为若重组率为100%100%，则转化后产生，则转化后产生101044个重组克隆需要：个重组克隆需要：10 1044/10/1077 X 10 X 10-2-2=0.1 =0.1 mmg g 载体载体DNADNA

25、 考虑到实验系统的重组率为考虑到实验系统的重组率为20%20%，所以实际投入载体应为：，所以实际投入载体应为：0.1/20%=0.50.1/20%=0.5 mmg g 载体载体DNADNA 载 体 投 入 量 确 定 后，外 源载 体 投 入 量 确 定 后，外 源D N AD N A的 投 入 量 即 可 按的 投 入 量 即 可 按（5 5 mmgg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选。），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选。第24页/共65页转化率转化率 转化率的影响因素转化率的影响因素载体及载体及DNADNA重组分子方面：重组分子方面：载体本身的性质：载体本身的性质：不同

26、的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。载体的空间构象：载体的空间构象：质 粒 的 超 螺 旋 构 象 转 化 率 最 高，经 酶 切 连 接 操 作 后 的 载 体 由 于质 粒 的 超 螺 旋 构 象 转 化 率 最 高，经 酶 切 连 接 操 作 后 的 载 体 由 于空 间 构 象 难 以 恢 复，其 转 化 率 一 般 要 比 新 制 备 的 超 螺 旋 质 粒 低空 间 构 象 难 以 恢 复，其 转 化 率 一 般 要 比 新 制 备 的 超 螺 旋 质 粒 低两个数量级。两个数量级。插入片段的大小：插入片段的大小：对质粒载体而言，插入

27、片段越大，转化效率越低。对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。第25页/共65页转化率转化率转化率的影响因素转化率的影响因素受体细胞方面：受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322pBR322转化大肠杆菌转化大肠杆菌JM83JM83株，转化率很株，转化率很低；但对大肠杆菌低；但对大肠杆菌ED87 67ED87 67株的转化率则株的转化率则较高。较高。第26页/共65页转化率转化率 转化率的影响因素转化率的影响因素转化方法方面：转化方法方面：受体细胞的预处理：受体细胞的预处理：影响最大影响最大供受体的比例：供受体的比例：CaCa2+2+诱导转

28、化诱导转化 0.1 0.1 ml ml 感受态感受态细胞细胞 50 50 ng DNAng DNA 转化方法：转化方法：CaCa2+2+诱导转化诱导转化 101066-10-1077/mmg DNAg DNA 原生质体转化原生质体转化 101099 个个原生质体原生质体 50 50 ng DNAng DNA 原生质体转化原生质体转化 101055-10-1066/mmg DNAg DNA ll-DNA-DNA转染转染 101077-10-1088/mmg DNAg DNA 电穿孔转化电穿孔转化 101066-10-1099/mmg DNAg DNA 第27页/共65页转化细胞的扩增转化细胞的扩

29、增扩增操作扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：操作往往与转化操作偶联在一起，如：CaCa2+2+诱导转化后的诱导转化后的3737培养一个小时；培养一个小时；原生质体转化后的再生过程；原生质体转化后的再生过程；ll噬菌体转染后的噬菌体转染后的3030培养等，均属扩增操作。培养等，均属扩增操作。第28页/共65页转化细胞的扩增转化细胞的扩增扩增操作的目的扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛

30、选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定表达外源基因，便于筛选和鉴定 第29页/共65页C 转化子的筛选和鉴定（检）3 3 重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程载体遗传标记检测载体遗传标记检测克隆克隆DNADNA序列检测序列检测外源基因产物检测外源基因产物检测第30页/共65页C 转化子的筛选和鉴定（检）3 3 重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转

31、化转化子子与非转化子与非转化子、重组子重组子与非重组子、与非重组子、目的重组子目的重组子与非目的重组子。与非目的重组子。转化子转化子重组子重组子目的重组子目的重组子第31页/共65页载体遗传标记检测载体遗传标记检测抗药性筛选法抗药性筛选法抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法的基本原理：ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bpori抗药性筛选法可区分转化子与非转抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。化子、重组子与非重组子。将外源将外源DNADNA片段插在片段

32、插在EcoRIEcoRI位点：位点：非重组子呈非重组子呈 ApAprr、TcTcr r 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcr r 将外源将外源DNADNA片段插在片段插在BamHIBamHI位点：位点：非重组子呈非重组子呈 ApAprr、TcTcr r 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcss 第32页/共65页载体遗传标记检测载体遗传标记检测抗药性筛选法抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：抗药性筛选法的基本操作：先 将 转 化 液 涂 布 含 有先 将 转 化 液 涂 布 含 有A pA p的 平 板，的 平 板，再再将将A pA p平 板 上 的 转 化 子 影 印 至平 板 上

33、 的 转 化 子 影 印 至含 有含 有A pA p和和TcTc的平板上。的平板上。在在ApAp平板上生长、但在平板上生长、但在ApAp和和TcTc平板平板上上不长的转化子即为重组子。不长的转化子即为重组子。ApApAp+TcAp+Tc影印影印挑选挑选第33页/共65页载体遗传标记检测载体遗传标记检测营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法的基本原理：营养缺陷型筛选法的基本原理：营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身

34、不能合成这一营养组份，理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。第34页/共65页载体遗传标记检测载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法显色筛选法的基本原理：显色筛选法的基本原理：显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生

35、颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18pUC18携带的携带的lacZlacZ基因（蓝色反应）、链霉菌质粒基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702pIJ702携带的携带的melCmelC基因（黑色反应）等。基因（黑色反应）等。第35页/共65页载体遗传标记检测载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法显色筛选法的基本操作：显色筛选法的基本操作：Ap+X-galAp+X-gal重组子（重组子（ApAprr+lacZ+lacZ-）将将外外源源基基因因克克隆隆在在pUC18pUC18的的lacZ lacZ 标标记记基基因因内内部部，使使之之灭灭活活，此此时时重重组

36、组子子为为ApAprr、lacZlacZ-基基因因型型，乳乳白白色色菌菌落落；而而非非重重组组子子则则为为ApAprr、lacZlacZ+基因型的基因型的蓝色菌落。蓝色菌落。pUC18AprlacZori第36页/共65页克隆克隆DNADNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法 所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNADNA片段进行酶切图谱分析，片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的

37、重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。量极大，实验成本也高。第37页/共65页克隆克隆DNADNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEEPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1

38、.0 kb0.8 kb0.8 kb区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子用用BamHIBamHI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA；电泳观察酶解产物片段。电泳观察酶解产物片段。重组子：重组子：2.7 2.7 kb+4.0 kbkb+4.0 kb非重组子：非重组子：2.7 2.7 kbkb如果外源如果外源DNADNA片段也是片段也是2.7 2.7 kbkb，最好最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子后通过其长度来鉴定其是否为重组子第38页/共65页克隆克隆DNADNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法

39、：全酶解图谱法：区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子如果外源如果外源DNADNA片段插在片段插在pUC18pUC18的的SphISphI位点处，原则上也可用位点处，原则上也可用SphISphI酶解鉴定，但这样做很不经济，酶解鉴定，但这样做很不经济，因为因为SphISphI非常昂贵（每非常昂贵（每100100单位单位5050美元）。用美元）。用HindIIIHindIII和和EcoRIEcoRI联联合酶解同样可以达到目的，但这合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及两种酶的价格只及SphISphI的的1/501/50。pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIII Sph

40、I PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIApAprrlacZlacZorioriSSSSBBPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb第39页/共65页克隆克隆DNADNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI

41、KpnI EcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEEPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子用用EcoRIEcoRI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA目的重组子：目的重组子：3.0 3.0 kb+3.7 kbkb+3.7 kb 或者：或者：1.0 1.0 kb+5.7 kbkb+5.7 kb用用PstIPstI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA目的重组子：目的重组子：3.2 3.2 kb+3.5 kbkb+3.5 kb 或者：或者：0.8 0.8 kb+5.9 kbkb+

42、5.9 kb第40页/共65页克隆克隆DNADNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEE4.0 kb4.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子对图示的克隆片段，转化子质粒对图示的克隆片段，转化子质粒DNADNA用

43、用EcoRIEcoRI酶切开后，只出现酶切开后，只出现2.0 2.0 kbkb和和2.7 2.7 kbkb两条带子，实际上两条带子，实际上2.0 2.0 kbkb的条带中含有两种不同的的条带中含有两种不同的2.7 kb2.7 kb2.0 kb2.0 kbEE分子。分子。第41页/共65页克隆克隆DNADNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法部分酶解图谱法：部分酶解图谱法：2.2 kb2.2 kbPstI EcoRI BamHIPstI EcoRI BamHIBBBBEE4.4 kb4.4 kb1.2 1.2 1.8 kb1.8 kbEEBB0.6 0.6 0.8 0.8 该重组质

44、粒经酶解后，分别得到下列几组数据：该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：BamHIBamHI全酶解：全酶解：0.6 0.8 1.8 3.4 0.6 0.8 1.8 3.4 kbkbBamHI+EcoRIBamHI+EcoRI全酶解：全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kbkb其中，其中，1.2 1.2 kbkb片段的存在表明该片段位于一端。片段的存在表明该片段位于一端。BamHIBamHI部分酶解：部分酶解：1.4 2.6 4.0 1.4 2.6 4.0 kbkb其中，其中，1.4 1.4 kbkb的片段必为的片段必为0.6 0.6 kb

45、kb和和0.8 0.8 kbkb两片段，表两片段，表明两者是连在一起的；同理，明两者是连在一起的；同理，2.6 2.6 kbkb的片段必为的片段必为0.8 0.8 kbkb和和1.8 1.8 kbkb两片段，表明两者是连在一起的；最后，两片段，表明两者是连在一起的；最后，4.0 4.0 kbkb的片段必为的片段必为0.6 0.6 kbkb和和3.4 3.4 kbkb两片段，表明两者两片段，表明两者是连在一起的。是连在一起的。第42页/共65页克隆克隆DNADNA序列检测序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法 菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或菌落或噬菌斑原位杂交法

46、的工作原理是根据克隆的目的基因或DNADNA片段的同源片段的同源序列设计并合成序列设计并合成探针探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNADNA同源同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。第43页/共65页克隆克隆DNADNA序列检测序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法菌落原位杂交法的基本操作：菌落原位杂交法的基本操作：影印影印用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板；用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板；洗涤洗涤杂交杂交感光感光用用0.40.4NN的的NaOHNaOH溶液浸泡影印薄

47、膜；溶液浸泡影印薄膜；用用SSCSSC溶液浸泡清洗影印薄膜溶液浸泡清洗影印薄膜；8080烘干固定影印薄膜；烘干固定影印薄膜；薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温；薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温；用用SSC-SDSSSC-SDS液洗涤杂交薄膜；液洗涤杂交薄膜；用用XX光胶片覆盖薄膜感光。光胶片覆盖薄膜感光。洗涤洗涤压片压片第44页/共65页克隆克隆DNADNA序列检测序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的制备：杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构（双链单链结构（双链DNADNA可用碱变性）可用碱

48、变性）足够长度（至少足够长度（至少1212个个碱基）碱基）内部不含互补区内部不含互补区 探针的制备方法或来源包括：探针的制备方法或来源包括：人工合成人工合成 cDNAcDNA合成合成 同源序列同源序列 mRNAmRNA 第45页/共65页克隆克隆DNADNA序列检测序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：逆转录酶逆转录酶介导的反转录标记介导的反转录标记33AAAAAAAAAAACCAGCUUCCAAAAAAAAAAACCAGCUUCCGGAACUGAUUUAGGCUAACUGAUUUAGGCU55mRNAmRNA反转录酶反转录酶MgMg2+2+dNTP+

49、dNTP+ppppppddATPATP（aa-3232P-dATPP-dATP）55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT55mRNAmRNA33cDNAcDNA33AAAAAAAAAAACCAGCUUCCAAAAAAAAAAACCAGCUUCCGGAACUGAUUUAGGCUAACUGAUUUAGGCU55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTCGGGTCGAAAAGGGGCTTGCTTGAACTCTAAAAAATCCGTCCGAA第46页/共65页克隆克隆DNADNA序列检测序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：DNADNA聚合酶

50、聚合酶介导的缺刻前移标记介导的缺刻前移标记5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 5 5 MgMg2+2+5 5 dNTP dNTP 5 5 pppppp dA dA（aa-3232P-dATPP-dATP）5 5 GG-CC-TT-C AC A-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 5 5 5 5 GG-CC-TT-CC-A-GA-G-CC-TT-GG