重组人干扰素生产工艺课程.pptx

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1、 重组人干扰素生产工艺三组主要内容主要内容l干扰素概述l基因工程假单胞杆菌的构建与保藏（菌种）l干扰素的发酵工艺过程l干扰素的分离纯化工艺过程干扰素概述干扰素概述l干扰素的种类l干扰素的理化性质l干扰素的生物学活性l干扰素的临床应用l干扰素的生产工艺路线干扰素干扰素l概念：干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。简称IFN。l发现：干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种

2、物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。干扰素的理化性质干扰素的理化性质143-166aa；MW:18-40 ku；pI:6.5-7.5；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纤维膜、琼脂和塑料等介质。型干扰素具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但这种效应不是直接的，而是通过对宿主细胞的作用引起的。对干扰素敏感的细胞表面存在干扰素受体，该细胞核内有“抗病毒蛋白”基因，受干扰素作用后该基因活化，产生的抗病毒蛋白可阻

3、止病毒mRNA翻译，并促进病毒mRNA降解。干扰素能提高细胞表面MHC类分子的表达水平，受到病毒感染的细胞表面MHC类分子的增加有助于向Tc细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解。干扰素可增强NK细胞（自然杀伤免疫细胞）对病毒感染的杀伤能力。干扰素的生物学活性干扰素的生物学活性正常情况下组织或血清中不含干扰素，只有在某些特定因素的作用下才能诱使细胞产生干扰素。广谱抗病毒活性机制广谱抗病毒活性机制干扰素合成及作用宿主细胞（白细胞）宿主细胞（白细胞）抗肿瘤作用机制型干扰素能型干扰素能抑制细胞的抑制细胞的DNADNA合成合成，减慢减慢细胞细胞 的的有丝分裂有丝分裂速度；这种抑制作用有明显的选择速度；这种抑制

4、作用有明显的选择 性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强 500 50010001000倍。另外，倍。另外，型干扰素也可通过增型干扰素也可通过增 强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其 抗肿瘤效应。抗肿瘤效应。干扰素原始品种价格在干扰素原始品种价格在10002000 10002000 多，多，产量很低。运用生物技术生产后的价格在产量很低。运用生物技术生产后的价格在40604060之间，之间，而且产量也很乐观，运用价值大大提升。而且产量也很乐观，运用价值大大提升。免疫调节活性机制免疫调节活性机制 免疫调节作用表现

5、在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。l对巨噬细胞的作用：IFN可使巨噬细胞表面MHC类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。l对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFN对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFN能增强TH

6、1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFN不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。l对其它细胞的作用：IFN对其他细胞也有广泛影响：刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力；活化NK细胞，增强其细胞毒作用；使某些正常不表达MHC类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHC类分子，发挥抗原递呈作用；使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞（增强免疫系统）。重组干扰素的临床应用重组干扰素的临床应用l广谱抗病毒活性（rhuIFN）慢性乙型、丙型

7、、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。l直接抗肿瘤活性（rhuIFN）毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。l免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFN）l多发性硬化症 rhuIFN干扰素生产工艺路线（干扰素生产工艺路线（1）体外诱生干扰素制备工艺体外诱生干扰素制备工艺：l Sendai病毒诱导人白细胞l1989年：IFN-n3，批准上市l产量低：1g IFN，需要 3亿ml人血白细胞l来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵l潜在的血源性病毒污染的可能性干扰素生产工艺路线干扰素生产工艺路线（2）人源转化细胞系培养生产工艺：人源转化细胞系培养生产工艺：l 1999年：IFN-n1,批

8、准用于临床。l 优点：首次实现大规模商业化生产。l 缺点：活性低，退出临床应用。干扰素生产工艺路线干扰素生产工艺路线（3）l上市产品：rhuIFN-1al1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)l表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 kul工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格动物无限细胞系培养生产工艺：动物无限细胞系培养生产工艺：干扰素生产工艺路线干扰素生产工艺路线（4）上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；20012002：PEG化I

9、FN，PEG-Intron,Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:基因工程基因工程假单胞杆菌假单胞杆菌的构建与保藏的构建与保藏 l基因工程假单胞杆菌菌种建立l基因工程假单胞杆菌菌种特性l菌种库的建立与保藏基因工程假单胞杆菌菌种建立基因工程假单胞杆菌菌种建立l第一步：干扰素-2b基因的克隆l第二步：表达载体的构建l第三步：工程菌的构建第一步：干扰素基因的克隆第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)l制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，l基因连接质粒,

10、转化E.coli,筛选鉴定克隆。l测序：编码人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。第二步：表达载体构建 IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体第三步：工程菌构建第三步：工程菌构建l转化假单胞杆菌l筛选高表达、稳定遗传的工程菌l获得原始菌种基因工程菌的特性基因工程菌的特性（1）具有宿主菌的特征：细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明状,粘稠。（2）具有生产干扰素能力：放射性免疫学效价不低于2.0109 IU/L。菌种库的建立与保藏菌种库的建立与保藏 QC（质量控制）：菌种特性、生产能力、质粒稳定性 菌种

11、检查合格后，方可投产。干扰素-2b的发酵工艺过程摇瓶培养摇瓶培养l取保存工作种子批菌种，室温融化l摇瓶培养：30，pH7.0，250 r/min，182hl检测：OD值和发酵液杂菌检查。种子罐培养种子罐培养l 接种：接入50L种子罐，接种量10%。l 培养：30，pH7.0。l 控制：级联调节通气量和搅拌转速DO（溶解氧）为30%，34h，OD（吸光度）4.0。l 检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。LB培养基培养基lLB培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种,使菌种成倍扩增,达到使用要求.培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌.通过

12、培养工程菌,我们可以表达大量的外源蛋白,也可以拿到带有外源基因的质粒.这个名字来源於英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。（贝尔尼塔）发酵罐培养发酵罐培养l接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。l控制：级联调节通气量和搅拌转速。l前4h：30，pH7.0，DO为30%。l4h后：20，pH6.0，DO为60%，56.5h。l终点控制：OD值达9.01.0，5冷却水快速降温至15以下。l检测：发酵液杂菌检查菌体收集菌体收集l连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。l菌体保存：20冰柜，不超过12个月。l检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构

13、一致性、质粒稳定性。干扰素的分离纯化工艺过程干扰素的分离纯化工艺过程 干扰素分离工艺过程 干扰素的纯化工艺过程干扰素干扰素-2b分离工艺过程分离工艺过程l菌体裂解l预处理l初级分离(1)菌体裂解菌体裂解l裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7.5）l使用保护剂：EDTA，PMSF。l破碎20菌体：2厘米以下的碎块l搅拌：加裂解缓冲液，210，2hrl冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。EDTAl本品为钙离子络合剂，洗涤剂，血液抗凝剂。生化研究中用作钙螯合剂，消除微量重金属导致的酶催化反应中的抑制作用。PMSF分离纯化剂，有剧毒，使用时微量即可。(2)预处理预处理-沉淀沉淀l加絮凝剂聚乙烯亚胺:21

14、0，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。l加凝聚剂醋酸钙溶液:210,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。(3)离心离心l连续流离心机：210，16000 r/minl收集上清液：含有重组干扰素蛋白质l杂质沉淀：121、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。（4）初级分离）初级分离l盐析:4M硫酸铵，210，搅匀,静置过夜。l离心：连续流离心机，16000 r/minl保存：收集沉淀，粗干扰素，4保存。干扰素纯化工艺过程干扰素纯化工艺过程l溶解粗干扰素l沉淀与疏水层析l阴离子交换层析与浓缩l阳离子交换层析与浓缩l凝胶过滤层析l无菌过滤分装(1)溶解粗干扰素溶解粗干扰素l配制纯化缓冲液：超纯

15、水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 m滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至210。l检查:缓冲液的pH值和电导值。l溶解：210，匀浆，完全溶解。(2)沉淀与疏水层析沉淀与疏水层析l等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。l疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白l洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。l等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，210，静置过夜l超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。l透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。(3)阴离子交换层析与浓

16、缩阴离子交换层析与浓缩l0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。l盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱，l配合SDS-PAGE收集干扰素峰。l浓缩：调整溶液和电导，10 ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。（4)阳离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩l用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。l上样，相同缓冲液冲洗。l盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱l配合SDS-PAGE收集干扰素峰。l浓缩：10 ku超滤膜进行。(5)凝胶过滤层析凝胶过滤层析l洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂l上样，相同缓冲液进行洗脱。l合并干扰素部分(6)无菌过滤分装无菌过滤分装l0.22 m滤膜过滤干扰素溶液，分装l20以下的冰箱中保存。(7)检测项目检测项目l干扰素鉴别试验l干扰素效价测定l蛋白质含量，纯度测定，分子量l宿主残余蛋白、残余DNAl干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列l其他：热原，内毒素，残留抗生素谢谢观看