11DNA重组技术的基本工具ppt.pptx

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1、基因工程基因工程专题专题1烟草烟草据据据据WTOWTOWTOWTO调查：调查：调查：调查：20042004年全世界年全世界年全世界年全世界因狂犬病致死人数约因狂犬病致死人数约因狂犬病致死人数约因狂犬病致死人数约5.55.5万人万人万人万人中国卫生部通报：中国卫生部通报：中国卫生部通报：中国卫生部通报：20042004年年年年月，狂犬病列法定报告传染病月，狂犬病列法定报告传染病月，狂犬病列法定报告传染病月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。死亡数之首。死亡数之首。死亡数之首。发病死亡率近发病死亡率近发病死亡率近发病死亡率近100%100%能产生狂犬病抗体能产生狂犬病抗体蛋白的转基因蛋白的转基因每

2、每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取猪或牛的胰腺中仅可提取45g。1979年，美国将年，美国将人的胰岛素基因人的胰岛素基因重组到重组到大肠杆菌大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药治疗糖尿病特效药 据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素思考思考：转基因技术转基因技术转基因技术转基因技术实现了实现了实现了实现了一种生物一种生物一种生物一种生物的某些的某些的某些的某些性状性状性状性状在在在在另一种生物另一种生物另一种生物另一种生物中中中中表达表达表达表达。这些性

3、状的表达与我们学这些性状的表达与我们学这些性状的表达与我们学这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？过的基因的什么过程有关？过的基因的什么过程有关？过的基因的什么过程有关？密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！DNA(DNA(基因基因基因基因)mRNA mRNA 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质(性状性状性状性状)转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译通用通用抗虫害的玉米抗虫害的玉米转鱼抗寒基转鱼抗寒基因的番茄因的番茄转基因转基因鲑鱼鲑鱼基因工程产品转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒乳汁中含有人生长激乳汁中含有人生长激素的转基因牛素的转基因牛(阿

4、根廷阿根廷)基因工程的概念n基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过计，通过体外体外DNA重组和转基因等技术重组和转基因等技术，赋，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的需要的新的生物类型和生物产品新的生物类型和生物产品。基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达人类需要的基因产物人类需要的基因产物基础理论和技术发展催

5、生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路早早期期基基础础理理论论达尔文达尔文达尔文达尔文提出提出提出提出生物进化论生物进化论生物进化论生物进化论基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路早早期期基基础础理理论论孟德尔孟德尔孟德尔孟德尔提出基因的提出基因的提出基因的提出基因的分离定律分离定律分离定律分离定律和和和和自由组合定律自由组合定律自由组合定律自由组合定律基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路早早期期基基础础理理论论 摩尔根摩尔根摩尔根摩尔根证明证明证明证明基因在染色

6、体上基因在染色体上基因在染色体上基因在染色体上，并提出基，并提出基，并提出基，并提出基因的因的因的因的连锁互换定律连锁互换定律连锁互换定律连锁互换定律。基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论 艾弗里艾弗里艾弗里艾弗里证明证明证明证明DNADNA是遗传物质是遗传物质是遗传物质是遗传物质，DNADNA可从可从可从可从一种生物个体一种生物个体一种生物个体一种生物个体转移转移转移转移到另一种生物个体。到另一种生物个体。到另一种生物个体。到另一种生物个体。基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路

7、科技探索之路后后期期基基础础理理论论 沃森沃森沃森沃森、克里克克里克克里克克里克提出提出提出提出DNADNA的的的的双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构模型。模型。模型。模型。基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论梅塞尔松梅塞尔松梅塞尔松梅塞尔松、斯塔尔斯塔尔斯塔尔斯塔尔证明证明证明证明DNADNADNADNA的的的的半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论克里克克里克克里克克里克等提出等提出等提出等提出中

8、心法则中心法则中心法则中心法则DNADNARNARNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译逆转录逆转录逆转录逆转录复制复制复制复制基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路后后期期基基础础理理论论 1963196319631963年年年年尼伦伯格尼伦伯格尼伦伯格尼伦伯格和和和和马太马太马太马太破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的破译编码氨基酸的遗传密码遗传密码遗传密码遗传密码，19661966年年年年霍拉纳霍拉纳霍拉纳霍拉纳用实验加以证明。用实验加以证明。用实验加以证明。用实验加以证明。基础理论和技术发展催生了基因工

9、程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路1)基因转移载体的发现基因转移载体的发现2)工具酶的发现工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现体外重组的实现5)重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功6)第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明技术的发明基础理论和技术的发展催生了基因工程 nDNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明nDNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立n遗传密码的破译遗传密码的破译n基因转移载体的发现基因转移载体的发现n工具酶的发明工具酶的发明nDNA合成和测序技术的发明合成和测

10、序技术的发明nDNA体外重组的实现体外重组的实现n重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功n第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世nPCR技术的发明技术的发明基础理论基础理论技术发明技术发明问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想想一想需要做哪些关键工作？需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒蛋白毒蛋白毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫

11、棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因通过运载体导入通过运载体导入通过运载体导入通过运载体导入转基因棉花含转基因棉花含抗虫基因抗虫基因转基因棉花产生转基因棉花产生伴胞晶体伴胞晶体转基因棉花有转基因棉花有抗虫特性抗虫特性一、一、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来

12、提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与棉花与棉花DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因进入棉花细胞进入棉花细胞一、一、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因与棉花抗虫基因与棉花DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针分子缝合针”DNADNA

13、连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体一、一、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具DNA重组技术的基本工具 n限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”nDNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”n基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运分子运输车输车”思考：思考：自然界是否存在一种生物的自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？进入另一生物的情况？动物容易让外来动物容易让外来DNA侵入自身而得以遗传吗？侵入自身而得以遗传吗？为什么？植物呢？为什么？植物呢？原核生物，容易遭到入侵吗？原核生物，容易遭到入侵吗

14、？原核生物并没有在进化中灭绝，而是产生了一些特殊的原核生物并没有在进化中灭绝，而是产生了一些特殊的酶来防范。这些酶应该有什么特点？酶来防范。这些酶应该有什么特点？可能酶能识别外来侵入的可能酶能识别外来侵入的可能酶能识别外来侵入的可能酶能识别外来侵入的DNADNA并将其分解，而对自身的并将其分解，而对自身的并将其分解，而对自身的并将其分解，而对自身的DNADNA不能起作用。不能起作用。不能起作用。不能起作用。“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶主要来源：主要来源：原核生物原核生物限制酶在原核生物中的作用 n原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是

15、，的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利侵入时，会利用限制酶将外源用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。、使之失效，从而达到保护自身的目的。n含有某种限制酶的细胞，其含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具分子中或者不具备这种

16、限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。不能将其切开。限制酶的种类与命名：现在已经从约现在已经从约300种微生物中分离出了约种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶种限制性内切酶(限制酶限制酶)。E EcocoR RS Smama粘质沙雷氏杆菌粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌（EscherichiaEscherichia coli coli R R）练习：流感嗜血杆菌的练习：流感嗜血杆菌的d d菌株菌株(

17、Haemophilus influenzae d)Haemophilus influenzae d)中先后分离到中先后分离到3 3种限制酶，则分种限制酶，则分 别命名为别命名为:Hind、Hind和和Hind限制酶的作用特点作用特点：作用特点：能够识别能够识别双链双链DNADNA分子的某种分子的某种特定特定的的核苷酸序列，并且使核苷酸序列，并且使每一条链中每一条链中特定特定部位部位的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开断开切点：切点：磷酸二酯键磷酸二酯键举例：举例：EcoEcoRIRI限制酶能识别限制酶能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间

18、切开之间切开限制酶的识别序列：限制酶的识别序列：限制酶所识别的序列有什么特点 n限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6个碱个碱基还是基还是4个碱基，都可以找到一条个碱基，都可以找到一条中中心轴线心轴线，中轴线两侧的双链，中轴线两侧的双链DNA上的上的碱基是碱基是反向对称重复反向对称重复排列的。排列的。限制酶切割的结果限制限制酶酶EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端Sma平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端黏性末端和平末端要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性酶切几个切口？可产生几个黏性(平平)末端

19、？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端末端，然后让两，然后让两者的黏性者的黏性(平平)末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合起来，就似乎可以合成重组的成重组的DNA分子了。分子了。思考思考?GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGEcoREcoRG G G

20、 GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGGG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGG不同来源的不同来源的不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合片段混合片段混合将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的DNADNA片段连接起来片段连接起来片段连接起来片段连接起来生物生物生物生物A A基因片段基因片段基因片段基因片段生物生物生物生物B B基因片段基因片段基因片段基因片段G G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGG

21、GGG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGG酶切酶切酶切酶切二、二、“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶作用作用:把切下来的把切下来的DNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNA，即将即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来.作用原理：作用原理：催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成DNA连接酶“分子缝合针”n连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为称之为Ecoli连接酶。另一种是从连接酶。另一种是从T4噬菌体中分噬菌体中分离得到，称为离得到，称为T4连接酶。连接酶

22、。n这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链的缺口，而不能连接单链DNA。nEcoli连接酶只能连接黏性末端；连接酶只能连接黏性末端；T4连接酶既连接酶既可可“缝合缝合”黏性末端，又可黏性末端，又可“缝合缝合”平末端。平末端。可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，Ecoli DNAEcoli DNA连接酶连接酶连接酶连接酶或或或或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶即即即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个

23、核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶比较：比较：类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能

24、连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别（二）（二）“分子缝合针分子缝合针”DNA连接连接酶酶DNA聚合酶DNA连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同点相同点寻根问底寻根问底DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条

25、DNADNA链为模板链为模板，将将将将单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上的双链上的两两个缺口同时连接个缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板三、三、“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体思考：假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车作为分子运输车载体，如果没有切割位点将载体，如果没有切割位点将会怎样？

26、会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？基因的载体“分子运输车”载体必须具备的条件：载体必须具备的条件：1 1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2 2、具有、具有1-1-多个限制酶切点，以便与外源基因连接；多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3 3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因

27、等 ）4 4、对受体细胞无害、对受体细胞无害载体的作用：载体的作用：1、将外源基因转移到受体细胞中去。、将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。制。常用的载体有：常用的载体有：质粒，质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等噬菌体的衍生物，动植物病毒等质粒 质粒是基因工质粒是基因工程最常用的运载体，程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外中，是细菌染色体外能够自主复制的很小能够自主复制的很小的环状的环状DNA分子，分子，大小只有普通细菌拟大小只有普通细菌拟核核DNA的百分之一。的百分

28、之一。要对天然质粒进行人工改造要对天然质粒进行人工改造以下是两种限制酶切割后形成的以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：片段，试分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中其中和和 是由一种限制酶切割形成的是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个末端，两者要重组成一个DNA 分子，所用分子，所用DNA连接连接酶通常是酶通常是 。（2）和和 是由另一种限制酶切割形成的是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常片段，所用的连接酶通常是是 。反馈练习：反馈练习：达标练习达标练习n在基因工程中，切割运载

29、体和含有目的基因在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的的DNA片段，需使用（片段，需使用（）A.同种限制酶同种限制酶 B.两种限制酶两种限制酶C.同种连接酶同种连接酶 D.两种连接酶两种连接酶n基因工程常用的受体细胞有（基因工程常用的受体细胞有（）(1)大肠杆菌大肠杆菌 （2）枯草杆菌）枯草杆菌（3）支原体）支原体 （4）动植物细胞）动植物细胞A.（3）（）（4）B.（1）（）（2）（）（4）C.（2）（）（3）（）（4）D.（1）（）（2）（）（3）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基基互补配对的步骤是互补配对的步骤是 （）A、人工合成目的基因人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C