重组DNA技术与基因工程(PPT 92页).pptx

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1、重组DNA技术与基因工程5 2 3 4 1 6 重组重组DNADNA技术与基因工程的基本概念技术与基因工程的基本概念重组重组DNADNA技术所需的基本条件技术所需的基本条件重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达A A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征5 5 外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有全基因组测序，

2、共有44054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国被美国FDAFDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物A A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征5 5 外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象

3、不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素B B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理5 5 外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达启动子启动子终止子终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子质粒拷贝数质粒拷贝数启动子启动子 启动子最佳距离的探测启动子最佳距离的探测目的基因目的基因EEEEAAEEEE启动子启动子A A 酶切开酶切开Bal31Bal31酶解酶解目的基因目的基因启动子启动子 启动子的筛选启动子的筛选ApAprroriorigalKgalKpKO1pKO1终止

4、密码子终止密码子采用鸟枪法战略，将合适大小的采用鸟枪法战略，将合适大小的DNADNA片段片段克隆到启动子探针质粒克隆到启动子探针质粒pKO1pKO1上。上。受体细胞染色体受体细胞染色体DNADNA上的上的galEgalE、galTgalT与质与质粒上报告基因粒上报告基因galkgalk的表达产物联合作用，的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化转化galEgalE+、galTgalT+、galKgalK-的大肠杆菌受体菌株的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆含有外源启动子活性的重组克隆启动子启动子 启动子的构建启动子的构建-35

5、-35 区序列区序列-10-10 区序列区序列P Pl ll lLLP PrecArecAP PtrptrpP PlaclacP PtraAtraAP Ptactac启动子启动子T T G A C AT T G A C AG A T A C TG A T A C TT T G A T AT T G A T AT A T A A TT A T A A TT T G A C AT T G A C AT T A A C TT T A A C TT A G A C AT A G A C AT A A T G TT A A T G TT T T A C AT T T A C AT A T A A TT

6、A T A A TT T G A C AT T G A C AT A T A A TT A T A A TP Ptactac =3 3 P Ptrptrp =1111 P Placlac启动子启动子 启动子的可控性启动子的可控性PP乳糖启动子乳糖启动子P Placlac的可控性：的可控性：OOPPOO高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白诱导诱导乳糖乳糖 异丙基异丙基-bb-D-D-硫硫代半乳糖苷（代半乳糖苷（IPTGIPTG）野生型的野生型的P Placlac与其控制区与其控制区O Olaclac偶联在一起，在没有偶联在一起，在没有诱导物存在时，操纵子诱导物存在时，操纵子基底水平转录基底水平转录处

7、于基底水平表达；诱处于基底水平表达；诱导物可以使启动子导物可以使启动子P Placlac介介导的转录大幅提高。导的转录大幅提高。启动子启动子 启动子的可控性启动子的可控性PPlaclac乳糖启动子乳糖启动子P Placlac的可控性：的可控性：OOPPlaclacOO高效转录高效转录葡萄糖代谢葡萄糖代谢野生型的野生型的PPlaclac上游附近拥有代谢上游附近拥有代谢激活因子（激活因子（CAPCAP）结合区，小结合区，小分子分子cAMPcAMP激活激活CAPCAP，CAPCAP结结基底水平转录基底水平转录启动子控制区，进而促进启动子控制区，进而促进PPlaclac介介导的转录。葡萄糖代谢使导的转

8、录。葡萄糖代谢使cAMPcAMP减少，也能阻遏减少，也能阻遏PPlaclac介导的基因介导的基因转录。因此，基因工程中使用转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即谢阻遏的突变型，即PPlac lac UV5UV5。CAPCAPcAMPcAMPcAMPcAMP浓度降低浓度降低PPlac lac UV5UV5OO高效转录高效转录PPtrptrp色氨酸启动子色氨酸启动子P Ptrptrp的可控性：的可控性：OOtrptrp除去除去色氨酸色氨酸色氨酸启动子色氨酸启动子PPtrptrp受色氨酸受色氨酸-阻遏阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底蛋白复合物

9、的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸状态。在培养系统中去除色氨酸基底水平转录基底水平转录或者加入或者加入3-3-吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸（IAAIAA），），便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加中往往添加IAAIAA诱导诱导PPtrptrp介导的目介导的目基因的表达。基因的表达。色氨酸色氨酸或加或加3-3-吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白 （IAAIAA）OOtrptrpPPtrptrp高效转录高效转录OOtrptrpPPtrp

10、trp启动子启动子 启动子的可控性启动子的可控性l l 噬菌体噬菌体启动子启动子P Pl ll lLL的可控性：的可控性：噬菌体启动子噬菌体启动子PPLL受受CICI阻遏蛋白阻阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基因遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的工程中常使用温度敏感型的cIcI突突变基因变基因cIcI857857控制控制PPLL。cIcI857857阻遏蛋阻遏蛋白在白在目的基因的表达。但在大型细菌目的基因的表达。但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达用色氨酸间接

11、控制目的基因表达PPtrptrpAABBcIcI857857PPLL目的基因目的基因阻遏作用阻遏作用PPtrptrpAABBPPLL表达表达色氨酸色氨酸启动子启动子 启动子的可控性启动子的可控性终止子终止子 强化转录终止的必要性强化转录终止的必要性 外外源源基基因因在在强强启启动动子子的的控控制制下下表表达达，容容易易发发生生转转录录过过头头现现象象，即即RNARNA聚聚合合酶酶滑滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNADNA序列，形成长短不一的序列，形成长短不一的mRNAmRNA混合物混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：过长转

12、录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转转录录产产物物越越长长，RNARNA聚聚合合酶酶转转录录一一分分子子mRNAmRNA所所需需的的时时间间就就相相应应增增加加，外外源源基基因因本身的转录效率下降；本身的转录效率下降；如如果果外外源源基基因因下下游游紧紧接接有有载载体体上上的的其其它它重重要要基基因因或或DNADNA功功能能区区域域，如如选选择择性性标标记记基基因因和和复复制制子子结结构构等等，则则RNARNA聚聚合合酶酶在在此此处处的的转转录录可可能能干干扰扰质质粒粒的的复复制制及及其其它它生生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长

13、的过长的mRNAmRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更更为为严严重重的的是是，过过长长的的转转录录物物往往往往不不能能形形成成理理想想的的二二级级结结构构，从从而而大大大大降降低低外外源源基因编码产物的翻译效率。基因编码产物的翻译效率。终止子终止子 强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌止子是来自大肠杆菌rRNArRNA操纵子上的操纵子上的rrnTrrnT11T T22以及以及T7T7噬菌体噬菌体DNADNA上的上的T Tf f。对对

14、于一些终止作用较弱的终止子，通常于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结可以采用二聚体终止子串联的特殊结pCP1pCP1ApAprrorioriTcTcrr筛选筛选ApAprr、TcTcss的转化子的转化子 终止子也可以象启动子那样，通终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基构，以增强其转录终止作用。构，以增强其转录终止作用。基因组基因组DNADNA中克隆筛选。中克隆筛选。核糖体结合位点核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而

15、且在很大程度上还与率，而且在很大程度上还与mRNAmRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的菌细胞中结构不同的mRNAmRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。别有时可高达数百倍。mRNAmRNA翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其5 5 端的结构序端的结构序列所决定，称为列所决定，称为核糖体结合位点核糖体结合位点（RBSRBS），大约涉及，大约涉及3030个碱基个碱基的长度的长度大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位位于于翻

16、翻译译起起始始密密码码子子上上游游1010个个碱碱基基内内的的序序列列 55-UAAGGAGG-UAAGGAGG 33，即即Shine-DalgarnoShine-Dalgarno（SDSD）序序列列，它它通通过过识识别别大大肠肠杆杆菌菌核核糖糖体体小小亚亚基基中中的的1616S S rRNA rRNA 33端端区区域域3 3 AUUCCUCC AUUCCUCC 55并并与与之之专专一一性性结结合合，将将mRNAmRNA定定位于核糖体上，从而启动翻译；位于核糖体上，从而启动翻译；翻翻译译起起始始密密码码子子，大大肠肠杆杆菌菌绝绝大大部部分分基基因因以以AUGAUG作作为为阅阅读读框框架架的的起

17、起始始位点，但有些基因也使用位点，但有些基因也使用GUGGUG或或UUGUUG作为翻译起始密码子；作为翻译起始密码子；SDSD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；基因编码区基因编码区55端若干密码子的碱基序列端若干密码子的碱基序列；核糖体结合位点核糖体结合位点 核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSD序列的影响序列的影响：一般来说，一般来说，mRNAmRNA与核糖体的结合程度与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种越强，翻译的起始效率

18、就越高，而这种结合程度主要取决于结合程度主要取决于S DS D序 列 与序 列 与1616S S个换成嘧啶碱基（个换成嘧啶碱基（CC或或T T），），均会导致翻译效率大幅度降低。均会导致翻译效率大幅度降低。5 UAAGGAGG 35 UAAGGAGG 35 AGGAGG 35 AGGAGG 35 GAGG 35 GAGG 3保保守守程程度度增增强强rRNArRNA的碱基互补性，其中以的碱基互补性，其中以AGGAGGAGGAGG尤其是尤其是GAGGGAGG四至六个嘌呤碱四至六个嘌呤碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四至六个嘌呤碱基中任何一基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四至六个嘌呤碱基中

19、任何一核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSD序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响：SDSD序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为AAAAAAAA或或UUUUUUUU，翻译效率最高；而翻译效率最高；而CCCCCCCC或或GGGGGGGG的翻译效率则分别是最高值的的翻译效率则分别是最高值的50%50%和和25%25%。紧邻。紧邻AUGAUG的前三的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b b-半乳糖苷酶半乳糖苷酶mRNAmRNA而而言，在这个位置上最佳的碱基

20、组合是言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAUUAU或或CUUCUU，如果用如果用UUCUUC、UCAUCA或或AGGAGG取代之，则酶的表达水平低取代之，则酶的表达水平低2020倍。倍。核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSD序列与起始密码子之间的距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响：SDSD序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNAmRNA在核糖体在核糖体上定位后，翻译起始密码子上定位后，翻译起始密码子AUGAUG正好处于核糖体复合物结构中的正好处于核糖体复合物结构中的P P位，这是翻

21、译启动的前提条件。在很多情况下，位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SDSD序列位于序列位于AUGAUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。会导致翻译起始效率不同程度的降低。核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响起始密码子及其后续若干密码子的影响起始密码子及其后续若干密码子的影响：大肠杆菌中的起始大肠杆菌中的起始tRNAtRNA分子可以同时识别分子可以同时识别AUGAUG、GUGGUG和和UUGUUG三三种起始密码子，但其

22、识别频率并不相同，通常种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUGGUG为为AUGAUG的的50%50%而而UUGUUG只及只及AUGAUG的的25%25%。除此之外，从。除此之外，从AUGAUG开始的前几个密码子碱基开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNAmRNA的的5 5 端非编码区形成茎端非编码区形成茎 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与环结构，否则便会严重干扰环结构，否则便会严重干扰mRNAmRNA在核糖体上的准确定位。在核糖体上的准确定位。启动子来

23、源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。密码子密码子 生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量生物基因组中的碱基含量 在富含在富含ATAT的生物（如单链的生物（如单链DNADNA噬菌体噬菌体f fX174X174）基因组中，密码子第三位上的基因组中，密码子第三位上的U U和和A A出现的频率

24、较高；而在出现的频率较高；而在GCGC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G G或或C C的简并密码子的简并密码子占占90%90%以上的绝对优势。以上的绝对优势。密码子与反密码子相互作用的自由能密码子与反密码子相互作用的自由能 中等强度规律中等强度规律 细胞细胞内内tRNAtRNA的含量的含量如如GGGGGG、CCCCCC、GCGGCG、GGCGGC、AAAAAA、UUUUUU、AUAAUA、UAUUAU等使用少；等使用少；如如GUGGUG、CACCAC、UCGUCG、AGCAGC、ACAACA、UGUUGU、AUCAUC、UUGUUG等使用

25、多；等使用多；密码子密码子 生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性 SDSD样序列样序列 Gene-WeiGene-Wei LiLi et alet al.NatureNature.484484（73957395）20122012细菌全细菌全mRNAmRNA范围的核糖体作图发现，在营养丰富的条件下，稀有范围的核糖体作图发现，在营养丰富的条件下，稀有tRNAtRNA所对应的密码子并不导致翻译迟缓。取而代之的是，基因编码区所对应的密码子并不导致翻译迟缓。取而代之的是，基因编码区内的内的SDSD样样序列序列高频引发核糖体在高频引发核糖体在mRNAmRNA上的翻译停顿。这种停顿是由上的翻译停顿。

26、这种停顿是由于于mRNAmRNA与正在翻译着的核糖体上与正在翻译着的核糖体上16S rRNA16S rRNA之间的碱基配对造成的。之间的碱基配对造成的。因此，均由嘌呤碱基构成的密码子在原核细菌蛋白质编码基因中是不因此，均由嘌呤碱基构成的密码子在原核细菌蛋白质编码基因中是不受欢迎的，如：受欢迎的，如：AGGAGG、GGAGGA、GAGGAG、GGGGGG，尤其是其，尤其是其双密码子组合双密码子组合翻译启动翻译启动翻译停顿翻译停顿mRNAmRNA密码子密码子 密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程由于原核生物和真核

27、生物基因组中密码子的使用频率具有较大程度的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高度的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高 效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：化学合成外源基因化学合成外源基因同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因编码基因 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并

28、密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌外源基因全合成：外源基因全合成：密码子密码子 密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响中的高效表达均采用了这种方法。中的高效表达均采用了这种方法。密码子密码子 密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响 对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNAtRNA编码基因同步克隆表达编码基因同步克隆表达

29、的策略较为有利。例如，在人尿激酶原的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNAcDNA的的412412个密码子中，共含个密码子中，共含有有2222个精氨酸密码子，其中个精氨酸密码子，其中7 7个个AGGAGG、2 2个个AGAAGA，而大肠杆菌受体细胞而大肠杆菌受体细胞中中tRNAtRNAAGGAGG和和tRNAtRNAAGAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNAcDNA在大肠在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNAtRNA编码基因克隆在另一个编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解

30、除了受体高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因：编码基因：细胞对外源基因高效表达的制约作用。细胞对外源基因高效表达的制约作用。质粒拷贝数质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增长期内，而此时正是细菌生理代谢

31、最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道。轨道。质粒拷贝数质粒拷贝数质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制 pCP3 pCP3拥有一个温度可诱导型的复拥有一个温度可诱导型的复pCP3pCP3PPLLMCSMCSorioriApAprr制子。在制子。在数为数为606

32、0；在；在300 300 600 600。在此温度下，受体细胞染。在此温度下，受体细胞染色体上的色体上的CICI基因表达的温度敏感型阻遏基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活。因此，用一种手段可同时控蛋白失活。因此，用一种手段可同时控制质粒拷贝数和基因的表达。制质粒拷贝数和基因的表达。C C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略5 5 外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋

33、白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 包涵体及其性质包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为溶性的结构称为包涵体包涵体（Inclusion BodiesInclusion Bodies，IBIB）。）。富含蛋白质的包涵富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些体多

34、见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNADNA、RNARNA和和脂多糖等非蛋白分子。脂多糖等非蛋白分子。包涵体型异源蛋白的

35、表达包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点能简化外源基因表达产物的分离操作能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体表达形式的优点：包涵体表达形式的优点：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。解物中分离出来。能在一定程度上保持表达产物的结构稳定能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组在形

36、成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁。蛋白的稳定性已构不成威胁。包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的缺点：包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物

37、的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的分子中的CysCys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过一般不超过30%30%。包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的操作以包涵体形式表达目的蛋白的操作 如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%20%以上时，表达产以上时，表达

38、产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在。法的长处所在。包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作C C 共价修饰的蛋白质共价修饰的蛋白质蛋白质变性复性的动力学原理：蛋白质变性复性的动力学原理：CC11CC22CCnnCCUUI I 11I I nnNNXX11XX22XXnnXXAgAgAgAgAgAgAgAgI I 有效变复性过程中的中间状

39、态有效变复性过程中的中间状态X X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态N N 天然状态的蛋白质天然状态的蛋白质U U 变性状态的蛋白质变性状态的蛋白质A A 集聚状态的蛋白质集聚状态的蛋白质 在细菌细胞内，集聚状态和在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作

40、。包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键，包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键，在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：涵体溶解变性的试剂和条件包括：清洗剂清洗剂 促溶剂促溶剂成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应；成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应；混合溶剂混合溶剂 极端极端pHpH包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作SDSSDS、正十二醇肌氨酸

41、，廉价，但影响复性和纯化；正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化；盐酸胍盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形如如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强；尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强；廉价，但许多蛋白质在极端廉价，但许多蛋白质在极端pHpH条件下发生修饰反应。条件下发生修饰反应。包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refoldingrefolding）：）：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：通过次级键

42、的形成使蛋白质复性通过次级键的形成使蛋白质复性将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refoldingrefolding）：）：复性操作复性操作包涵体复性操作的方法包括：包涵体复性操作的方法包括：分段稀释法，分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生一步稀释法，一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大试剂添加法，试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEGPEG、CaCa2+2+蛋白修饰法，

43、蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔离法，产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侣法，分子伴侣法，GroELGroEL、GroESGroES、DnaKDnaK，固定化，共表达固定化，共表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refoldingrefolding）：）：二硫键形成二硫键形成 在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防在包涵体变性体系中，始终存在

44、着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防 化学氧化法（化学氧化法（AA）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是随机需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是随机 二硫键交换（二硫键交换（BB）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSHGSH和和GSSGGSSG），），二硫键形成二硫键形成止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新配对止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有：形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有

45、：的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠；的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠；相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好。相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好。HSHSHSHS S S S S+22ee+22HH+AAHSHSHSHS S-S-R S-S-R HS HS+BBR-S-S-RR-S-S-R S S S S22R-SHR-SH包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定

46、位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物产物NN端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达 以分泌形式表达目的蛋白的优缺点以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的优点：分泌表达形式的优点：目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳

47、定性大约是在细胞质中的定性大约是在细胞质中的1010倍。倍。目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白相当多的真核生物成熟蛋白N N端并不含有端并不含有 甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质 N N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠 杆菌的杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N N端端 的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去。的甲硫氨酸残基

48、便可在信号肽的剪切过程中被有效除去。分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达以分泌形式表达目的蛋白的优缺点以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的缺点：分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式数外源基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌

49、尽管有，但并不普遍。尽管有，但并不普遍。分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达蛋白质的分泌机制蛋白质的分泌机制原核细菌周质中含有多种原核细菌周质中含有多种分子伴侣分子伴侣可阻止分泌蛋白可阻止分泌蛋白的随机折叠的随机折叠，分泌在细胞分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫白很少形成分子间的二硫键交联，因此与包涵体相键交联，因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感对蛋白酶不敏感。DsbCDsbC纠正错配的二硫键纠正错配的二硫键分泌型异源蛋白的

50、表达分泌型异源蛋白的表达 分泌型目的蛋白表达系统的构建分泌型目的蛋白表达系统的构建 包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内上的磷酸酯酶上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。，导致细菌内外膜的通透性增大。因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上因此，只要将细菌素释放蛋