DNA重组技的基本工具.pptx

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1、定向基因改造设想定向基因改造设想 设想设想一一能否让禾本科的植物也能够固定能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？空气中的氮？能否让细菌能否让细菌“吐出吐出”蚕丝蚕丝？设想设想二二能否让微生物产生出人的胰岛素、能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？干扰素等珍贵的药物？设想设想三三经过多年的努力，科学家于经过多年的努力，科学家于2020世纪世纪7070年年代创立了可以定向改造生物的新技术代创立了可以定向改造生物的新技术基基因工程因工程。专题专题1基因工程：基因工程：又叫做又叫做基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重组技术重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物通俗的说，

2、就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后导然后导入入受体细胞受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内体细胞内表达表达，产生出人类所需要的，产生出人类所需要的基因产物基因产物,定向定向地改造生物的地改造生物的遗传性状遗传性状。原原 理：理：操作水平：操作水平：结结 果：果：目的基因目的基因供体细胞供体细胞受体细胞受体细胞基因重组基因重组DNADNA分子水平分子水平定向地改造生物的遗传性状，定向地改造生物的遗传性状，获得获得人类所需要的品种。人类所需要的品种。(细菌等微细菌等微生物生物)（一）基因工程

3、的概念（一）基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达请你回答：请你回答：转基因抗虫棉转基因抗虫棉抗虫棉抗虫棉普通棉普通棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：（一）基因工程的概念（一）基因工程的概念普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因棉花细胞棉花细胞(含抗虫

4、基因含抗虫基因)棉花植株棉花植株(有抗虫特性有抗虫特性)重组重组DNA导入导入形成形成解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？1 1 DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具 关键步骤一的工具：关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：分子手术刀分子手术刀分子缝合针分子缝合针 分子运输车分子运输车限制性内切酶限制性内切酶DNADNA连接酶连接酶运载体运载体一、一、“分子手术刀分子手术刀”人会被细菌入侵而得病，细菌会被其他的人会被细菌入侵而得病，细菌会被其他

5、的生物入侵吗？生物入侵吗？人靠什么来防御入侵？那么细菌呢？人靠什么来防御入侵？那么细菌呢？限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 1、来源：、来源：原核生物（原核生物（原核生物（原核生物（细菌细菌细菌细菌或或或或霉菌霉菌霉菌霉菌）中分离纯化出来）中分离纯化出来）中分离纯化出来）中分离纯化出来的一种酶。的一种酶。的一种酶。的一种酶。2、种类：、种类：4000种种为什么不会剪切细菌本身的为什么不会剪切细菌本身的DNA？在长期进化过程中，含有哪种限制酶，就不在长期进化过程中，含有哪种限制酶，就不具备相应的序列；或者通过甲基化酶将甲基具备相应的序列；或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别的序列中，使限制酶不能将

6、其转移到所识别的序列中，使限制酶不能将其断开。断开。限制酶的作用是什么？限制酶的作用是什么？EcoREcoRSma识别：识别：（6 6 6 6个核苷酸，个核苷酸，个核苷酸，个核苷酸，4 4 4 4、5 5 5 5或或或或8 8 8 8）DNA DNA DNA DNA 分子的某种分子的某种分子的某种分子的某种特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列AATTGCCTTAAG断开：断开：磷酸二酯键磷酸二酯键断开后的末端是怎样的？断开后的末端是怎样的？大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶的一种限制酶能识别能识别GAATTC序列序列，并在并在G和和A之间切开。之间切开。限

7、制酶限制酶什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？限制酶限制酶 被限制酶在识别序列的中轴线两侧将被限制酶在识别序列的中轴线两侧将DNA的两条的两条链分别链分别切开时，产生的是切开时，产生的是黏性末端。黏性末端。什么叫平末端？什么叫平末端？当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线处从识别序列的中心轴线处切开时，切开时，切开的切开的DNADNA两条单链的切口，是两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平整的，这样的切口叫平末端平末端。coRI限制酶限制酶SmaI限制酶限制酶识别序列识别序列切割位点切割位点和之间和之间和之间和之间未端类型未端类型平末端平末端粘性末端粘性末端3、作用、作用：4、结果：、结果：形成两

8、种末端形成两种末端形成两种末端形成两种末端粘性末端粘性末端平末端平末端特异性特异性识别：识别：DNA DNA 分子的某种分子的某种特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列（6 6个核苷酸，个核苷酸，4 4、5 5或或8 8）断开：断开：磷酸二酯键磷酸二酯键要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？酶切几个切口？可产生几个黏性末端？（二）基因操作的工具（二）基因操作的工具要切两个切口，产生四个黏性末端。要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来用同一种限制酶来切割，会怎样呢？切割

9、，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性末端相同的黏性末端，然后让两者的黏性然后让两者的黏性末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合成起来，就似乎可以合成重组的重组的DNA分子分子了。了。二、二、“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶有何区别？聚合酶有何区别？DNA连接酶连接酶以以DNADNA的一条链为模板合成的一条链为模板合成DNADNA双链双链DNAAG T AC A A A T AGCTGACGGTTT游离的脱氧游离的脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶AG T AC A A A T AGCTGACGGTTTDNADNA 聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合

10、酶AG T AC A A A T AGCGACGGTTTTDNADNA聚合酶聚合酶AG T AC A A A T GCGACGGTTTTADNADNA聚合酶聚合酶AG T AC A A A T GCGACGTTGTTADNADNA聚合酶聚合酶AG T AC A A A T GCGACGTGTTATDNADNA聚合酶聚合酶AG T AC A A A T GCGACGGTT AT TDNADNA聚合酶聚合酶AG T AC A A A T GCGACGGTTAT TADNADNA聚合酶聚合酶AG T AC A A A T GCGCGGTTAT TA TDNADNA聚合酶聚合酶AG T AC A A

11、A T GGCGGTTAT TA T CDNADNA聚合酶聚合酶AG T AC A A A T GGCGGTTAT TA T CDNADNADNA聚合酶聚合酶具有连接单链具有连接单链DNADNA的本领的本领 DNA连接酶可把黏性末端之间的连接酶可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，是把梯子两边扶手的断口连接起来，是把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的起来，这样一个重组的DNA分子才能形成。分子才能形成。DNADNA连接酶连接酶只可以连接双链只可以连接双链DNADNA1 1、分类：、分类：大肠杆菌：大肠杆菌：T4噬菌体：噬菌体：E.coliDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶作

12、用：作用：作用：作用：只能将粘性末端之间连接只能将粘性末端之间连接既可以既可以“缝合缝合”粘性末端，又粘性末端，又可以可以“缝合缝合”平末端（效率低）平末端（效率低）。运载体运载体将外源基因送入受体细胞将外源基因送入受体细胞。三、分子运输车三、分子运输车1.作用：作用：2 2.种类种类：质粒质粒、噬菌体和动植物病毒、噬菌体和动植物病毒。天然的质粒天然的质粒、噬菌体和动植物病毒是、噬菌体和动植物病毒是否都可以直接用做运载体？否都可以直接用做运载体？1.如果从如果从霍乱弧菌霍乱弧菌中分离出来的中分离出来的质粒来做载体，请问谁敢用它质粒来做载体，请问谁敢用它来做受体的载体？来做受体的载体？运载体运载

13、体DNADNA必需是可靠的必需是可靠的2.2.运载体运载体DNADNA要携带目的基因，要携带目的基因，如何携带？如何携带？运载体运载体DNA必需有一个或多必需有一个或多个限制酶切点个限制酶切点且切点必须在质粒本身需要且切点必须在质粒本身需要的基因片段之外的基因片段之外。3.3.运载体运载体DNADNA要携带目的基因进入后如何表达？要携带目的基因进入后如何表达？自我复制（整合到受体自我复制（整合到受体DNA上）上）4.4.如何确认目的基因进入受体细胞？并进行筛选？如何确认目的基因进入受体细胞？并进行筛选？带有标记基因带有标记基因3.3.条件：条件：必需是可靠的必需是可靠的必需有一个或多个限制酶切

14、点必需有一个或多个限制酶切点自我复制（整合到受体自我复制（整合到受体DNA上）上）带有标记基因带有标记基因运载体运载体DNA大小适合，便于提取和操作大小适合，便于提取和操作目前被较广泛提取目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。因、植物抗病基因等。基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤、提取目的基因、提取目的基因将将需要的基因从供体生物需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。的细胞内提取出来。供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶

15、剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶2 2、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合用与提取目的基用与提取目的基因相同的限制酶切割因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切质粒使之出现一个切口，将目的基因插入口，将目的基因插入切口处，让目的基因切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用后，在连接酶的作用下连接形成重组下连接形成重组DNADNA分子。分子。3 3、将目的基因导入受体细胞并使之扩增、将目的基因导入受体细胞并使之扩增导入导入扩增扩增要让目的基因表达，必要让目的基因表达，必须将它导入受体细胞并进行须将

16、它导入受体细胞并进行扩增。扩增。为获得目的基因的表达为获得目的基因的表达产物时，通常以大肠杆菌等产物时，通常以大肠杆菌等无害易得的细菌为受体。为无害易得的细菌为受体。为改进某种生物时，将欲改进改进某种生物时，将欲改进的生物细胞为受体。的生物细胞为受体。为使重组的为使重组的DNADNA分子更容易进入受体细胞，分子更容易进入受体细胞，通常还要用一些物质对受体细胞进行处理，使通常还要用一些物质对受体细胞进行处理，使受体细胞具有更大的通透性。受体细胞具有更大的通透性。4 4、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有

17、效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。必须将它从中检测出来。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。质粒的特点

18、质粒的特点1.1.细细胞胞染染色色体体（或或拟拟核核DNADNA分分子子）外外能能自自主主复制的小型环状复制的小型环状DNADNA分子；分子；2.2.质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的存在对宿主细胞无影响；3.3.质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒的复制只能在宿主细胞内完成。1.以下说法正确的是以下说法正确的是 （）A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因

19、连接 D、DNA连连接接酶酶使使黏黏性性末末段段的的碱碱基基之之间间形形成氢键成氢键C练习练习2.2.有关基因工程的叙述中，错误的是（有关基因工程的叙述中，错误的是（）A A、基基因因工工程程技技术术能能定定向向地地改改造造生生物物的的遗遗传传性性状状，培育生物新品种培育生物新品种 B B、重组、重组DNADNA的形成在细胞内完成的形成在细胞内完成 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体B D练习练习3.3.在基因工程中，切割运载体和含有在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的目的基因的DNADNA片段，需使用（片

20、段，需使用（）同种限制酶同种限制酶 B.B.两种限制酶两种限制酶同种连接酶同种连接酶 D.D.两种连接酶两种连接酶注意：要用同一种限制酶切取目的基因注意：要用同一种限制酶切取目的基因和运载体，并用和运载体，并用DNA连接酶连接。连接酶连接。练习练习4.不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD练习练习双基练习：双基练习：一、基因工程的概念一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计进行严格的设计,通

21、过体外通过体外_和和_等技术等技术,赋予生物以心得遗赋予生物以心得遗传特性传特性,创造出符合人们的需要的新的创造出符合人们的需要的新的_和和_.又叫做又叫做DNA的重组技术的重组技术.二、二、DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具 1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶-”分子手术刀分子手术刀”(1)主要来源主要来源:从从_生物中分离出来的生物中分离出来的.(2)特点特点:能够识别能够识别DNA特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列,切开切开 两个两个_之间的之间的_ .(3)DNA末端末端:限制酶切割限制酶切割DNA产生的产生的DNA末末端有两种形式端有两种形式:_和和_.2.DNA连接酶连接酶

22、-”分子缝合针分子缝合针”(1)作用作用:将双链将双链DNA_,恢复被限制酶切开的恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的两个核苷酸之间的_.(2)种类种类:E.coli DNA连接酶连接酶:只能缝合只能缝合DNA的的_ T4 DNA连接酶连接酶:既可缝合既可缝合DNA的的_,又可又可缝合双链缝合双链DNA的的_.3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体-”分子运输车分子运输车”(1)载体的种类载体的种类 质粒质粒:是一种裸露的是一种裸露的,结构简单结构简单,独立于细菌染独立于细菌染色体之外色体之外,并能够自我并能够自我_能力的双链能力的双链_ DNA 分子分子;_的衍生物的衍生物;_.(2)载体的特点载体的特点 能够在细胞内能够在细胞内_;有一个或多个有一个或多个_切割位点切割位点,便于供源便于供源DNA的插入的插入.具有具有_基基因因,供重组供重组DNA的鉴定和选择的鉴定和选择.假如目的基因导入受体细胞后不能复制假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？如果如果载体对受体细胞有害将怎样？如果不能分离会怎样？不能分离会怎样？对受体细胞无害，易分离对受体细胞无害，易分离