《DNA重组技术的基本工具》上课用.pptx

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1、1.1 DNA重组技术的基本工具一、教学目标：一、教学目标：1.简述简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。重组技术所需三种基本工具的作用。2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。术创新。二、教学重点：二、教学重点：DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。重组技术所需的三种基本工具的作用。三、教学难点：三、教学难点：基因工程载体需要具备的条件。基因工程载体需要具备的条件。一、自学导引：基因工程的原理：基因工程的原理：1.1.概念：概念：2.2.基因工程又叫基因工程又叫DNADNA重组技术。重组技术。3.3.过程：这种技术是在生物体过程：

2、这种技术是在生物体 ，通过对，通过对 分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”，对生物的，对生物的基因进行基因进行 和重新组合，然后导入受体细和重新组合，然后导入受体细胞内，进行胞内，进行 繁殖，使重组基因在受体细繁殖，使重组基因在受体细胞内表达。胞内表达。二、基础知识：4.基因工程的特点：基因工程的特点：1）它是一种按照人们意愿，）它是一种按照人们意愿，定向定向改造生物遗改造生物遗传特性的技术。传特性的技术。2）在）在DNA分子水平上进行操作。分子水平上进行操作。3）是在体外进行的人为的基因重组。）是在体外进行的人为的基因重组。4）一旦成功，便可遗传。）一旦成功，便可遗传。5）主

3、要技术是体外）主要技术是体外DNA重组技术和转基因重组技术和转基因技术。技术。基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程实质实质结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人们需要的新的生物类型和生人们需要的新的生物类型和生物产品物产品切割切割 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组总结：总结：基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌获取获取获取获取抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体

4、与运载体与运载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入棉花细胞棉花细胞(含含抗虫基因抗虫基因)棉花植株棉花植株(有有抗虫特性抗虫特性)上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体DNA连接连接关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因导入受体导入受体(棉花棉花)细胞细胞解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工

5、具：关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：“分子手术分子手术分子手术分子手术刀刀刀刀”限制性内切限制性内切限制性内切限制性内切酶酶酶酶“分子缝合分子缝合分子缝合分子缝合针针针针”DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶“分子分子运载车运载车”载体载体1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”限制酶主要是从原核限制酶主要是从原核微生物微生物中分离纯化出中分离纯化出来的。能识别双链来的。能识别双链DNA的某种特定的某种特定核苷酸序列核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸核苷酸之间之间 的的磷酸

6、二酯键磷酸二酯键断开。断开。特点：特异性。特点：特异性。即即一种一种限制酶限制酶只能识别一种只能识别一种特定的特定的核苷酸核苷酸序列序列，并且能在，并且能在特定的切点特定的切点上切割上切割DNA分子。分子。三、三、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具 大肠杆菌大肠杆菌(EcoR)的一种限制酶的一种限制酶能识别能识别GAATTC序列序列，并在，并在G和和A之间切开。之间切开。限制酶限制酶限制限制限制限制酶酶酶酶黏性末端和平末端黏性末端和平末端 当限制酶在它识别序列的中心轴线两当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是的两条链分别切开时，产生的是黏性末端

7、。黏性末端。而当限制酶在它识别序列的中而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是心轴线处切开时，产生的则是平末端。平末端。练习1、下列关于限制酶的说法不正确的是下列关于限制酶的说法不正确的是A限制酶广泛存在于各种生物中，微生物限制酶广泛存在于各种生物中，微生物中很少分布中很少分布B一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列序列C不同的限制酶切割不同的限制酶切割DNA的切点不同的切点不同D限制酶的作用是用来提取目的基因限制酶的作用是用来提取目的基因练习2、限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分分子上特定的核苷酸碱基

8、序列。下图为四种限制酶子上特定的核苷酸碱基序列。下图为四种限制酶BamHI，EcoRI，Hind以及以及Bgl的辨识序列。的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列为何？黏合？其正确的末端互补序列为何？A.BamHI和和EcoRI；末端互补序列；末端互补序列AATTB.BamHI和和Hind；末端互补序列；末端互补序列GATCC.EcoRI和和Hind；末端互补序列；末端互补序列AATTD.BamHI和和BglII；末端互补序列；末端

9、互补序列GATC要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性末端相同的黏性末端，然后让两者的，然后让两者的黏性末端黏性末端黏合黏合起来，就似乎可以合成重组的起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。分子了。（1）种类：）种类：（2）作用部位：）作用部位：Ecoli DNA连接酶连接酶（黏性末端）（黏性末端

10、）T4 DNA连接酶连接酶（黏性末端和平末端黏性末端和平末端）磷酸二酯键磷酸二酯键 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的个重组的DNA分子就形成了。分子就形成了。2 2、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”练习3、在基因工程中用来完成基因的剪接的工具在基因工程中用来完成基因的剪接的工具是是 A限制酶和连接酶限制酶和连接酶 B限制酶和水解酶限制酶和水解酶C限制酶和运载体限制酶和运载体 D连接酶和运载体连接酶和运载体练习4、依下图有关基因工程的工具酶功能

11、的叙述，依下图有关基因工程的工具酶功能的叙述，不正确的是不正确的是 A切断切断a处的酶为限制核酸性内切酶处的酶为限制核酸性内切酶 B连接连接a处的酶为处的酶为DNA连接酶连接酶C切断切断b处的酶为解旋酶处的酶为解旋酶 D切断切断b处的为限制性内切酶处的为限制性内切酶外源基因外源基因(如抗虫基因如抗虫基因)怎样才能导入受体细怎样才能导入受体细胞胞(如棉花细胞如棉花细胞)？导入过程需要运输工具导入过程需要运输工具载体载体。载体的作用有哪些？载体的作用有哪些？作用一作用一：作为运输工具，将外源基因：作为运输工具，将外源基因(抗虫抗虫基因基因)转移转移到受体细胞到受体细胞(棉花细胞棉花细胞)中去。中去

12、。作用二作用二：利用载体在受体细胞：利用载体在受体细胞(棉花细胞棉花细胞)内，内，对外源基因对外源基因(抗虫基因抗虫基因)进行进行大量复制大量复制。作为载体必须具备哪些条件？作为载体必须具备哪些条件？1 1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2 2）载体）载体）载体）载体DNADNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目必须有一个或多个限制酶切点，以便目必须有一个或多个限制酶切点，以便目必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。的基因插入到载体上去。的基因插入到载体上去。的基因

13、插入到载体上去。3 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。）具有某些标记基因，便于进行筛选。）具有某些标记基因，便于进行筛选。）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。4)载体载体载体载体DNADNA必须是安全的必须是安全的必须是安全的必须是安全的,不会对受体细胞有害不会对受体细胞有害不会对受体细胞有害不会对受体细胞有害,或不或不或不或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去能进入到除

14、受体细胞外的其他生物细胞中去能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去;5)5)5)载体载体载体载体DNADNA分子大小应适合分子大小应适合分子大小应适合分子大小应适合,以便提取和在体外进以便提取和在体外进以便提取和在体外进以便提取和在体外进行操作行操作行操作行操作,太大就不便操作太大就不便操作太大就不便操作太大就不便操作.3.基因进入受体细胞的运载基因进入受体细胞的运载”分子运输车分子运输车”常用的运载体主要有两类：常用的运载体主要有两类：1）细菌细胞质的）细菌细胞质的质粒质粒 2）噬菌体衍生物噬菌体衍生物或某些或某些动植物病毒动植物病毒质粒：质粒：质粒是一种裸露的、结构简单、独立质粒是一种裸露

15、的、结构简单、独立于细菌染色体之外，并具有于细菌染色体之外，并具有自我复制自我复制能力能力的双链环状的双链环状DNA分子分子 质粒质粒是基因工程是基因工程最常用的载体最常用的载体。绝大多数细菌质粒都是绝大多数细菌质粒都是闭合环状闭合环状DNA分子分子。有的一个细菌中有一个，有的一个。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。细菌中有多个。大肠杆菌的质粒：大肠杆菌的质粒：最常用的质粒是最常用的质粒是大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒，其，其中常含有中常含有抗药基因抗药基因，如四环素的标记基因如四环素的标记基因。质粒的。质粒的存在与否对存在与否对宿主细胞生存没有决宿主细胞生存没有决定性作用定性作用，但

16、，但复制只复制只能在宿主细胞内成能在宿主细胞内成。练习5、限制性内切酶限制性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶，限制性内切酶的识别序列和的识别序列和切点是切点是GATC。在质粒上有酶。在质粒上有酶的一个切点，的一个切点，在目的基因的两侧各有在目的基因的两侧各有1个酶个酶的切点。的切点。请画出质粒被限制酶请画出质粒被限制酶切割后形成的黏性未端。切割后形成的黏性未端。_请画出目的基因两侧被限制酶请画出目的基因两侧被限制酶切割后形成的切割后形成的黏性未端。黏性未端。_本节内容小结：1.知识梳理：知识梳理：DNA重组技术的基本工具：重组技术的基本工具：限制酶（分子手术

17、刀）：识别特定的核苷酸限制酶（分子手术刀）：识别特定的核苷酸序列并切割两核苷酸之间的磷酸二酯键；序列并切割两核苷酸之间的磷酸二酯键；DNA连接酶（分子缝合针）：连接两核苷酸连接酶（分子缝合针）：连接两核苷酸之间的磷酸二酯键；之间的磷酸二酯键；基因进入受体细胞的载体（分子运输车）：基因进入受体细胞的载体（分子运输车）：最常用的是细菌质粒，还有最常用的是细菌质粒，还有噬菌体的衍生物、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。动植物病毒等。2.方法、技巧、规律总结：限制酶切割的是磷酸二酯键，而限制酶切割的是磷酸二酯键，而DNA连接酶连接酶连接的正是两个断开此键的连接的正是两个断开此键的DNA片段。片段。“分分子

18、运输车子运输车”是目的基因进入受体细胞的载体，是目的基因进入受体细胞的载体，它具有的若干特点是基因工程鉴定、选择、它具有的若干特点是基因工程鉴定、选择、表达的关键，可以说，没有它，目的基因即表达的关键，可以说，没有它，目的基因即使进入受体细胞，也难以稳定保存，更谈不使进入受体细胞，也难以稳定保存，更谈不上复制和表达。上复制和表达。3.思维误区提示：思维误区提示：DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶根本不是同类酶，聚合酶根本不是同类酶，其功能特点大不相同，注意其区别。其功能特点大不相同，注意其区别。4.DNA连接酶和 DNA聚合酶的异同：基因工程中所用的连接酶有两种：从大肠杆菌中基因工程中所用的连

19、接酶有两种：从大肠杆菌中分离得到的分离得到的Ecoli连接酶、从连接酶、从T4噬菌体中分离得噬菌体中分离得到的到的T4连接酶。这两种酶的催化反应基本相同，连接酶。这两种酶的催化反应基本相同，都是连接双链都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链的缺口，而不能连接单链DNA。连接酶和聚合酶的作用都是形成磷酸二酯。连接酶和聚合酶的作用都是形成磷酸二酯键。键。DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而连末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而连接酶是在两个接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。片段之间形成磷酸二酯键。4.DNA连接酶和 DNA聚合酶的异同：DNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNA链为模板，将单链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成子链；而连个核苷酸通过磷酸二酯键形成子链；而连接酶是将接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接双链上的两个缺口同时连接起来，因此连接酶不需要模板。起来，因此连接酶不需要模板。两者都是由蛋白质构成的酶，但组成和性两者都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。质各不相同。