分光光度计的使用-顺德.ppt

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1、南方医科大学南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心分光光度分光光度计计的使用的使用分光光度法的概念分光光度法的概念v分光光度法是利用物质对光具有选择性吸收的特性而建立起来的一种定性或定量分析技术，也称为吸收光谱法。v是光谱分析技术中最常有的一种，应用最多的是紫外及可见分光光度法。v分光光度法所使用的光谱范围主要是波谱图中2001000nm为一段波长的光谱。v紫外光区200400nm 可见光区400760nm 红外光区7601000nm2009/11生物化生物化学与学与分子生物分子生物学学实验教学教学中心中心分光光度法的原理分光光度法的原理vLambert-

2、Beer定律（光吸收定律）溶液的质量浓度（C）越大，液层厚度越厚，则溶液对光线吸收得越多。当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（K为定值），溶液的吸光度与溶液中吸光物质的浓度成正比。所以通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的含量。2009/11生物化生物化学与学与分子生物分子生物学学实验教学教学中心中心I0CIIgI0I=KCLIgI0I表示溶液对光线的吸收程度，用吸光度（A）表示所以A=KCL2009/11生物化生物化学与学与分子生物分子生物学学实验教学教学中心中心如何求被测组分的含量如何求被测组分的含量v利用标准管计算测定物的含量 在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），同也

3、测定未知浓度（CU）的吸光度（AU），根据定律得：AU=KUCULU AS=KSCSLS 因为 KU=KS LU=LS 所以 AS与AU之比值也等于两浓度之比值 即 AU/AS=CU/CS CU=AUASCS2009/11生物化生物化学与学与分子生物分子生物学学实验教学教学中心中心如何求被测组分的含量如何求被测组分的含量v利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列已知浓度的测定物溶液，按测定管同样操作方法处理显色，分别读取各管的吸光度。以各管吸光度为纵坐标，测定物含量为横坐标；在方格坐标纸上作图即得标准曲线图。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓

4、度。2009/11生物化生物化学与学与分子生物分子生物学学实验教学教学中心中心吸光度A蛋白质浓度C（g/ml）0.20.40.6.40801201602009/11生物化生物化学与学与分子生物分子生物学学实验教学教学中心中心分光光度分光光度计计的基本的基本结结构构光源光源单色色光器光器吸收池吸收池测光光机机构构钨丝灯灯氢灯灯氘灯灯棱棱镜衍射光衍射光栅玻璃比色杯玻璃比色杯石英比色杯石英比色杯硒硒光光电池池光光电管管光光电倍增管倍增管2009/11生物化生物化学与学与分子生物分子生物学学实验教学教学中心中心分光光度计的工作原理分光光度计的工作原理v一束单色光通过有色溶液时，部分光线被吸收，末被吸收

5、的部分投射到光电管上，光电管将光能转变为电能，结果就出现光电流，光电流的强弱与溶液的吸光量强弱有关。v即若溶液的厚度不变，则溶液的浓度愈大，吸光度就愈大；反之，溶液的浓度愈小，吸光度就愈小。2009/11生物化生物化学与学与分子生物分子生物学学实验教学教学中心中心分光光度计使用的注意事项分光光度计使用的注意事项v比色杯应与分光光度计相配对，禁止随意挪用。v比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。v盛液时不能太满，外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。v测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉。2009/11生物化生物化学与学与分子生物分子生物学学实验教学教学中心中心南方医科大学南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心