基因表达的定量检测分析.ppt

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1、基因表达的定量检测分析 基因表达的定量检测方法1.蛋白表达水平的检测：1）定量检测分析：western blotting、ELISA、HPLC 2）蛋白质功能分析：蛋白质亚细胞定位分析：免疫荧光技术 蛋白相互作用研究：酵母双杂交、免疫共沉淀（IP）、荧光共振能量转移（FRET）酶活性检测：ELISA、HPLC2.mRNA表达水平检测：1）半定量RT-PCR 2）Northern blot 3）实时荧光定量PCR（Realtime PCR）Northern blot 杂交 是用来检测真核生物RNA的表达量和大小，以估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括：1.

2、完整mRNA的分离 2.根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离 3.将RNA 转移到固相支持物（尼龙膜）上，在转移的过程中，要保持RNA 在凝胶中的相对分布 4.将RNA固定到支持物上（UV交联）5.固相RNA与探针分子（DNA或RNA）杂交 6.除去非特异结合到固相支持物上的探针分子 7.对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析Realtime PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到

3、广泛应用。实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线或内参基因的关系对起始模板进行定量分析的方法。与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线

4、性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值荧光阈值和 CT 值值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（threshold value）几个常用名词概念1.Ct 值的

5、定义 C代表Cycle，t代表threshold（阈值，临界值），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。2.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10 SDcycle 3-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲

6、线上计算出该样品的起始拷贝数。前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的 最初阶段绝对定量分析：Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用相对定量分析相对定量分析必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。管家基因管家基因：维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如GAPDH、Actin、HPRT等优点：价格便宜，使用方便，不用设计复杂的探针。缺点：无模板特异性，对引物特异性要求比较高，不能进行多重定量分析Taqman ProbeMolecular Beacon背景荧光更低反应优化n反应液组成、体积n50ul绝对不必要n20ul应用广，但成本高n推荐10ul，但需要优化n引物与引物、引物与探针浓度配比n44组合，50nm,300nm,600nm,900nmn探针50nm,100nm,250nm qPCR一般使用二步PCR扩增，在退火-延伸整合步骤结束时进行信号检测。当PCR反映效率低时可以使用三步PCR扩增。染料法可以在72延伸结束时检测。探针法只能在退火结束时检测。qPCR可能出现的问题及解决方法阴性对照有信号阴性对照有信号