基因工程的基本操作程序讲稿.ppt

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1、一、基因工程的概念：一、基因工程的概念：又叫做又叫做基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重组技术重组技术。通。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，放到另一种生物的细胞里，定向定向地改造生物地改造生物的的遗传性状遗传性状。n n基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们

2、需要的新的生物类型和生物产品。们需要的新的生物类型和生物产品。1.限制酶和限制酶和DNA连接酶的作用分别是什么连接酶的作用分别是什么?限制酶的作用是能够识别双链限制酶的作用是能够识别双链DNA分子的某种分子的某种特定特定核苷酸序列核苷酸序列并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的间的磷酸二酯键断开磷酸二酯键断开 DNA连接酶的作用是连接酶的作用是连接连接被限制酶切开的两个核被限制酶切开的两个核苷酸之间的苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因

3、的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一一 原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点RNA聚合酶是一种聚合酶是一种蛋白蛋白质质，能，能识别并与调控序识别并与调控序列列中的中的结合位点结合结合位点结合，能能催化催化DNA转录为转录为RNA启动子终止子启启动子：子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它

4、是RNARNA聚合聚合酶识别和和结合的部位，有了它才能合的部位，有了它才能驱动基因基因转录出出mRNAmRNA，最，最终获得蛋白得蛋白质终止子：止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，能片断，能终止止mRNAmRNA的的转录一一 原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构与与RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶A G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CA G G U C A C G U C GA G G U

5、 C A C G U C GRNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶启动子终止子真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：原核细胞不具有剪切、拼接原核细胞不具有剪切、拼接原核细胞不具有剪切、拼接原核细胞不具有剪切、拼接mRNAmRNA的能力，所以真核细胞的能力，所以真

6、核细胞的能力，所以真核细胞的能力，所以真核细胞的基因不能在原核细胞的受体细胞中正确表达的基因不能在原核细胞的受体细胞中正确表达的基因不能在原核细胞的受体细胞中正确表达的基因不能在原核细胞的受体细胞中正确表达一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成(一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物

7、不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因，称为基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）限制酶限制酶基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装1)1)基因组文库基因组文库(Genomic library)(Genomic library)是指将某种生物体的是指将某种生物体的全部基全部基因组因组DNADNA用限制性内切酶或机械用限制性内切酶或机械力量切割成一定长

8、度范围的力量切割成一定长度范围的DNADNA片段，再与合适的载体在体外重片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文这个群体就称为该生物基因组文库库。其目的是分离有用的目的基。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。因和保存某种生物的全部基因。每个受体菌每个受体菌DNADNA分子都包含一段不同的分子都包含一段不同的外源外源DNADNA片段片段1）反转录法：）反转录法：聚焦二：目的基因的获取方法聚焦二：目的基因的获取方法 cDNAcDNA(互补互补DNA)DNA)蛋白质蛋白质mRNADNA推测推测推测推测DNAD

9、NA合成仪合成仪合成仪合成仪合成合成2）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNA法法：上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因思考思考:

10、为什么要构建基因文库为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗体内提取不行吗?利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因问题问题:为什么要扩增目的基因为什么要扩增目的基因?原理原理:碱基互补配对碱基互补配对原料原料:4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸条件条件:(1)引物引物:人工合成的一段核苷酸系列人工合成的一段核苷酸系列 (2)酶酶:DNA聚合酶聚合酶特点特点:快速快速(指数形式扩增指数形式扩增)过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火

11、、退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链5 5/3 3/G GG GT TC C3 3/5 5/G GA AC CC C聚焦二：目的基因的获取方法聚焦二：目的基因的获取方法 5 5/3 3/5 5/3 3/5 5/3 3/G GG GT TC C3 3/5 5/G GA AC

12、CC C5 5/3 3/引物引物G GG G高温高温变性变性低温低温复性复性中温中温延伸延伸5 5/3 3/A AG G引物引物聚焦二：目的基因的获取方法聚焦二：目的基因的获取方法 5 5/3 3/5 5/3 3/(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因第二课时第二课时1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。(二二)基因表达基因表达载体的构建体的构建核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处，再加入适

13、量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体目的：使目的基因在受体细胞中胞中稳定存定存在，并且可以在，并且可以遗传给下一代，同下一代，同时使目使目的基因能的基因能够表达和表达和发挥作用。作用。a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因等、标记基因等它们它们各自各自的作的作用是用是什么什么质粒的构建与改造质粒的构建与改造1)1)删删除除不不必必要要

14、的的DNADNA区区域域，缩缩小小分分子子量量，提提高高外源外源DNADNA片段装载量。片段装载量。2)2)灭活某些质粒的编码基因。灭活某些质粒的编码基因。3)3)加入易于识别的选择标记基因。加入易于识别的选择标记基因。4)4)加入特殊的基因表达调控元件。加入特殊的基因表达调控元件。一般来说，天然运载体往往不能满足人类的所有要一般来说，天然运载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的运求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的运载体进行人工改建。载体进行人工改建。(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导

15、入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因、将目的基因导入植物入植物细胞的方法：胞的方法：农杆菌杆菌转化法化法（1 1）农杆菌介杆菌介绍：（2 2）原理及适用范）原理及适用范围(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞适用于适用于适用于适用于单子叶植物单子叶植物单子叶植物

16、单子叶植物基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法 将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞方法：方法：显显微注射法微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、）原核生物特点：繁殖快、单细胞、胞、遗传物物质少少（2）方法：）方法：用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体表达载体与感受态细胞混合与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细

17、胞吸收DNA分分子子 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测检测检测步骤步骤步骤步骤目的目的目的目的方法方法方法方法原理原理原理原理工具工具工具工具现象现象现象现象1 1 1 1DNADNADNADNA分子分子分子分子杂交技术杂交技术杂交技术杂交技术碱基互碱基互碱基互碱基互补配对补配对补配对补配对放射性同位素作放射性同位素作放射性同位素作放射性同位素作标记的含目的基标记的含目的基标记的含目的基标记的含目的基因的因的因的因的DNADNADNADNA片段片段片段片段杂交带杂交带杂交带杂交带2 2 2 2检测目的基因检测目的基因检测目的基因检测目的基因是否转录出了是否转录出了是否转录出了是

18、否转录出了mRNAmRNAmRNAmRNADNADNADNADNA分子分子分子分子杂交技术杂交技术杂交技术杂交技术碱基互碱基互碱基互碱基互补配对补配对补配对补配对放射性同位素作放射性同位素作放射性同位素作放射性同位素作标记的含目的基标记的含目的基标记的含目的基标记的含目的基因的因的因的因的DNADNADNADNA片段片段片段片段杂交带杂交带杂交带杂交带3 3 3 3检测目的基因检测目的基因检测目的基因检测目的基因是否翻译成蛋是否翻译成蛋是否翻译成蛋是否翻译成蛋白质白质白质白质抗原抗原抗原抗原-抗抗抗抗体杂交体杂交体杂交体杂交抗体的抗体的抗体的抗体的专一性专一性专一性专一性特定抗体特定抗体特定抗

19、体特定抗体杂交带杂交带杂交带杂交带(阳阳阳阳性反应性反应性反应性反应)检测转基因生物的检测转基因生物的染色体染色体DNADNA上是否上是否插入了目的基因插入了目的基因DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。P P1

20、515思考与探究思考与探究问题探讨：问题探讨：将人体的基因转入大肠杆菌中，都能产生相应的将人体的基因转入大肠杆菌中，都能产生相应的基因产物吗？（例如要能否通过大肠杆菌生产人们基因产物吗？（例如要能否通过大肠杆菌生产人们所需要的糖蛋白是否可行？）所需要的糖蛋白是否可行？）1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （）A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接

21、D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C练习练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD D练习练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因

22、不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A A练习练习4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （）A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D D练习练习5）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱基互补配对的步骤是碱基互补配对的步骤是 （）A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C C练习练习质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）核心核心同一种同一种(二二)基因表达基因表达载体的构建体的构建4.4.过程过程: