实时荧光PCR技术.ppt

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1、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量技术的应用实时荧光定量技术的应用实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧，利用荧光信号累积光信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程

2、，最后通进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 实时原实时原理理 常常 规规 PCR PCR技术：技术：对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测检测实时定量实时定量PCRPCR技术：技术：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应扩增反应中中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值值和标和标准曲线

3、的分析对准曲线的分析对起始模板起始模板进行进行定量分析定量分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理定量原理原理定量原理介绍三个概念：介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理-扩增曲扩增曲线线扩增曲线图：扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光荧光阈阈值

4、值荧光信号荧光信号阈阈值值 （threshold threshold）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定义值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value 实时荧光定量实时荧光定量PCR

5、PCR 原理原理 -Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -定量原理定量原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标

6、准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理 绝对定量25讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时

7、荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记：2、TaqMan 3、Molecular Beacon 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -DNA -DNA 产物的荧光产物的荧光标记标记实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 1-1-SYBR Green 法SYBR Green SYBR Green 法 工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和

8、延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线熔解曲线分析分析温度温度荧光强度荧光强度TmTmTm值：值：DNADNA解链一半时的温度解链一半时的温度

9、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。将温度与荧光强度的变化求导。(-(-dI/dT)dI/dT)-dIdTTmSYBR Green SYBR Green 法法 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产非特异性产物物Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA concentrationSYBR Gree

10、n 法 定量原理q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少q Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化:1.SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer 体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围q 起始模板的测定q 基因

11、型的分析q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBR Green SYBR Green 法法 优缺优缺点点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点与目标序列互补实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2-TaqMan2-TaqMan法法TaqMan-水解型杂交探针v 5端标记有报告基团(Reporter,

12、R)，如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)v 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针TaqManTaqMan法法 工作原工作原理理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan TaqMan 法法 PCR PCR反应的建立反应的建立1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：一般为：94，10-20S 60，30-60S（Ta

13、q酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度 72，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同TaqManTaqMan法法 优缺点优缺点q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定q 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补q重复性比较好优 点q 只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针缺 点实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 3-Molecular beacon 3-Molecular beacon 法法(分子分子信标信标)标

14、记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针发夹型杂交探针Molecular beacon(Molecular beacon(分子信标分子信标)工作原工作原理理q 荧光共振能量转移（FRET）q 探针与DNA杂交时产生荧光 -变性过程：产生非特异性荧光 -延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号Molecular beacon(Molecular beacon(分子信标分子信标)应用范应用范围围 q 起始模板的定量q 基因型分析q 产物鉴定q SNP（单核苷酸多态性）分析Molecular beacon(Molecular bea

15、con(分子信标分子信标)优缺优缺点点q高高特异性：特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一q荧光背景低荧光背景低优 点q 只能用于一个特定目标q 设计困难q 价格比较高缺 点讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用实时荧光定量实时荧光定量PC

16、RPCR法法 标准样标准样品品相对定量中的内标相对定量中的内标 内标通常是内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒已知拷贝数的质粒DNA DNA 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品DNADNADNADNA拷拷拷拷贝数贝数贝数贝数 用于生成标准曲线的样品如何设定？用于生成标准曲线的样品如何设定

17、？含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的含有和待测样品相同扩增片段的cDNAcDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或根据质粒或cDNAcDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀分子量换算成拷贝数，做系列稀释释实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 定量方定量方法法q 绝绝对对定定量量检检测测起起始始模模板板数数的的精精确确拷拷贝贝数数，通通常常用用到标准曲线到标准曲线q 相相对对定定量量确确定定经经过过不不同同处处理理的的样样本本目目标标转转录录本本之之间基因的表达差异（不同时相）间基因的表达差

18、异（不同时相）实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 绝对定量绝对定量方法方法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 TaqMan TaqMan法举法举例例TaqMan法研究法研究ERBB2 在乳腺肿在乳腺肿瘤瘤 组织标本中的表达差异组织标本中的表达差异 TaqMan TaqMan法举例法举例 标记探标记探针针使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量q FamFam标记目标基因探针标记目标基因探针q VIC VIC标记看家基因探针标记看家基因探针TaqManTaqMan法举例法举例 材料准材料准备备q从正常乳腺组织中提取的从正常乳腺组织中提取的总总 RNA RNA q从乳腺癌组织中提取的

19、从乳腺癌组织中提取的 总总RNARNAq含含 ERBB2 and GAPDH ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准的质粒用于生成标准曲线曲线q单双通道同时进行，独立分析单双通道同时进行，独立分析qq ControlsControls no RNAno RNA：阴性对照阴性对照 RNA+no reverse transcriptaseRNA+no reverse transcriptase：基因组对照基因组对照TaqManTaqMan法举例法举例 癌症标记物癌症标记物表达表达Color 2-VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection f

20、or ERBB2TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 定量定量Copies ng/l Total RNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB21095 1052213024922.16 XGAPDH95500857301360001308001.45 XTaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 定量分定量分析析ERBB2 copies/GAPDH copies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019Healthy RNATumor RNA0.01150.0180.018/0.011GraphCopies ng/l Total RNATaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 表达差表达差异异HealthyTissueCarc.TissueRelative ExpressionERBB2的表达差异TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 讨论讨论通过通过RT-qPCR成功检测了成功检测了ERBB2基基因在不同组织的因在不同组织的 表达差异；在乳腺癌表达差异；在乳腺癌组织中，组织中，ERBB2的表达量是正常水平的表达量是正常水平的的1.8倍倍www.tw-