实验3植物叶片活细胞和叶绿体的分离提取及观察.ppt

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1、实验四实验四 植物叶片活细胞和叶绿体的分植物叶片活细胞和叶绿体的分离提取及观察离提取及观察College of Life Science and Technology,XINJIANG Univercity一、实验目的一、实验目的l初步掌握运用机械法分离活细胞和细胞器初步掌握运用机械法分离活细胞和细胞器的方法；的方法；l掌握运用差速离心或密度梯度离心分离纯掌握运用差速离心或密度梯度离心分离纯化叶肉细胞，细胞核，叶绿体的方法；化叶肉细胞，细胞核，叶绿体的方法；l掌握分离的细胞的活性鉴别方法；掌握分离的细胞的活性鉴别方法；l熟悉叶肉细胞或原生质体、细胞核、叶绿熟悉叶肉细胞或原生质体、细胞核、叶绿体

2、的形态大小。体的形态大小。二、实验原理二、实验原理 细胞器的分离是研究细胞器的结构、功能和化学细胞器的分离是研究细胞器的结构、功能和化学组成的技术基础，保持分离的细胞器的纯度、结构组成的技术基础，保持分离的细胞器的纯度、结构完整及其生理、生化活性是本实验的三大要素。细完整及其生理、生化活性是本实验的三大要素。细胞核是植物细胞中最大、最重要的细胞器，使细胞胞核是植物细胞中最大、最重要的细胞器，使细胞各种生命活动的指挥中心。各种生命活动的指挥中心。叶绿体是植物细胞进行叶绿体是植物细胞进行光合作用，将光能转变成化学能的重要细胞器。光合作用，将光能转变成化学能的重要细胞器。由由于它们的重要功能，所以它

3、们一直是细胞生物学、于它们的重要功能，所以它们一直是细胞生物学、遗传学、和分子生物学研究的重要对象。遗传学、和分子生物学研究的重要对象。利用离心利用离心技术可分离、纯化细胞、细胞核和叶绿体。技术可分离、纯化细胞、细胞核和叶绿体。将组织匀浆后悬浮在将组织匀浆后悬浮在等渗介质等渗介质中进行差速离心，是分离中进行差速离心，是分离各种细胞器的常用方法。颗粒在离心场中的沉降速率取决于各种细胞器的常用方法。颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。有关。在一给定的离心场中，一定时间内，密度和大小不同在一给定的

4、离心场中，一定时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同，依次增加离心力和离心时间，能使的颗粒其沉降速率不同，依次增加离心力和离心时间，能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分，最先沉淀的是管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分，最先沉淀的是细胞，其次是细胞核，接下来是叶绿体。细胞，其次是细胞核，接下来是叶绿体。悬浮介质通常用悬浮介质通常用缓冲的等渗溶液缓冲的等渗溶液，它，它与细胞质的分散相与细胞质的分散相接近接近，在一定程度上，在一定程度上能保持细胞器的真实结构和酶的活性能保持细胞器的真

5、实结构和酶的活性。二、实验原理二、实验原理三、实验用具和试剂三、实验用具和试剂1 1仪器：仪器：组织捣碎机、高速冷冻离心机、托盘天平、组织捣碎机、高速冷冻离心机、托盘天平、普通光学显微镜、剪刀、培养皿、普通光学显微镜、剪刀、培养皿、250ml250ml烧杯、量烧杯、量 筒、玻璃漏斗、移液管、离心管、滴管、滤纸、筒、玻璃漏斗、移液管、离心管、滴管、滤纸、纱布一大块或纱布一大块或400400目尼龙网、载玻片、盖玻片。目尼龙网、载玻片、盖玻片。2 2试剂试剂：SNTSNT溶液溶液：0.4M0.4M蔗糖蔗糖、0.01M 0.01M NaClNaCl 0.05M 0.05M Tris-HCLTris-H

6、CL缓冲液缓冲液 ：0.2M Tris 0.2M Tris（三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷）50ml50ml 0.1N HCL 50-55ml 0.1N HCL 50-55ml 两液混匀后，加蒸馏水至两液混匀后，加蒸馏水至200ml200ml，pH7.6pH7.6 1/3000 1/3000中性红染液中性红染液:称取称取0.50.5中性红溶于中性红溶于50ml Ringer50ml Ringer溶液，稍溶液，稍加热（加热（30400C30400C）使之很快溶解，用滤纸过滤，）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。

7、去染色能力。临用前，取已配制的临用前，取已配制的1%1%中性红溶液中性红溶液1ml1ml，加入加入29ml Ringer29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。溶液混匀，装入棕色瓶备用。香柏油香柏油3 3材料：新鲜菠菜材料：新鲜菠菜三、实验用具和试剂三、实验用具和试剂四、实验内容四、实验内容 1 1组织匀浆液的制备（组织捣碎法）。组织匀浆液的制备（组织捣碎法）。2 2细胞及细胞器（细胞核、叶绿体等）的分细胞及细胞器（细胞核、叶绿体等）的分 离、纯化（离心分离法）。离、纯化（离心分离法）。3 3细胞、细胞核、叶绿体的镜检（根据形态、细胞、细胞核、叶绿体的镜检（根据形态、大小、分布位置、数

8、量识别法）。大小、分布位置、数量识别法）。4 4分离细胞活性的鉴别（中性红活体染色分离细胞活性的鉴别（中性红活体染色 法）。法）。五、实验方法和步骤五、实验方法和步骤1 1取材：取材：取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后，除取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后，除 叶梗及粗脉，剪成小块。叶梗及粗脉，剪成小块。2 2匀浆：匀浆：将称取将称取60g60g叶片小块放入组织捣碎机套叶片小块放入组织捣碎机套 筒内，加入筒内，加入200ml SNT200ml SNT溶液，匀浆溶液，匀浆2020秒秒(最高最高 速度速度)制成匀浆液。制成匀浆液。3 3过滤：过滤：将匀浆液经四层纱布过滤，或将匀浆液经四层纱布过滤，或40040

9、0目尼目尼 龙网过滤，滤液分装离心管，平衡。龙网过滤，滤液分装离心管，平衡。l4 4离心：离心：滤液滤液l 200g200g（1000rpm/1000rpm/分）分）1 1分分l _ _l 沉淀沉淀1 1 上清上清,平衡平衡,离心离心 （含叶肉细胞）（含叶肉细胞）500g 500g（1500rpm/1500rpm/分）分）1 1分分l 沉淀沉淀2 2（含细胞核）（含细胞核）上清上清,平衡平衡,离心离心 1000g1000g（3000rpm/3000rpm/分）分）5 5分分 沉淀沉淀3 3 上清，弃上清，弃 （含大量叶绿体含大量叶绿体）5 5悬浮：悬浮：分别收集沉淀，用少量的分别收集沉淀，用少

10、量的SNTSNT溶液溶液 分别将沉淀分别将沉淀1 1、2 2、3 3悬浮。悬浮。6 6镜检：镜检：取悬浮液取悬浮液1 1、2 2分别做滴片镜检。分别做滴片镜检。然后加几滴中性红染色然后加几滴中性红染色5-10min5-10min，盖，盖 上盖玻片镜检。上盖玻片镜检。取悬浮液取悬浮液3 3做滴片盖上盖玻片，用油镜做滴片盖上盖玻片，用油镜 观察。观察。六、实验结果六、实验结果 1 1在普通光学显微镜下，在悬浮液在普通光学显微镜下，在悬浮液1 1滴片中可以看到含细胞核滴片中可以看到含细胞核和大量叶绿体的和大量叶绿体的叶肉细胞叶肉细胞（形态为球形或椭圆形的原生质体）。（形态为球形或椭圆形的原生质体）。

11、2 2在普通光学显微镜下，在悬浮液在普通光学显微镜下，在悬浮液2 2滴片中可以看到滴片中可以看到细胞核细胞核（形态为球形）。（形态为球形）。3 3在普通光学下，在悬浮液在普通光学下，在悬浮液1 1、2 2滴片中性红染色可以鉴别滴片中性红染色可以鉴别活细活细胞及细胞核胞及细胞核（中性红是液泡系特殊的活体染色剂，在细胞处（中性红是液泡系特殊的活体染色剂，在细胞处于生活状态时，中性红只将液泡染成红色，而细胞质及细胞于生活状态时，中性红只将液泡染成红色，而细胞质及细胞核不着色。如果细胞死亡，红色会弥散在整个细胞中）。核不着色。如果细胞死亡，红色会弥散在整个细胞中）。4 4在普通光学显微镜下，在悬浮液在

12、普通光学显微镜下，在悬浮液3 3滴片中可以看到滴片中可以看到叶绿体叶绿体（叶绿体为绿色椭圆形，在高倍镜下可以看到叶绿体内部含（叶绿体为绿色椭圆形，在高倍镜下可以看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒）。有较深的绿色小颗粒，即基粒）。七、实验注意事项七、实验注意事项1 1细胞和各种细胞器的分离应在等渗溶液中细胞和各种细胞器的分离应在等渗溶液中进行，以免渗透压的改变使细胞和细胞器进行，以免渗透压的改变使细胞和细胞器的受到损伤。的受到损伤。2 2要注意整个实验的分离过程必须在要注意整个实验的分离过程必须在0 055的条件下进行，避免酶的失活；如果在室的条件下进行，避免酶的失活；如果在室温下，要迅

13、速分离和观察。温下，要迅速分离和观察。3 3离心过程中要注意离心力和离心时间。离心过程中要注意离心力和离心时间。得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细胞器应注意的问题？胞器应注意的问题？八、实验作业八、实验作业1.1.绘制出一个完整的叶肉细胞图（内含细胞核、叶绿体）绘制出一个完整的叶肉细胞图（内含细胞核、叶绿体）。2.2.得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细胞器应注得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细胞器应注意哪些问题？谈谈意哪些问题？谈谈SNTSNT溶液中的各种成分的作用。溶液中的各种成分的作用。3.3.分离各种细胞器所需的相对离心力与哪些因素有关？分离各种细胞器所需的相对离心力与哪些因素有关？4.4.对你设计的实验的成败谈谈感想，提出改进的措施。对你设计的实验的成败谈谈感想，提出改进的措施。5.5.做哪些研究需要分离制备叶绿体？做哪些研究需要分离制备叶绿体？叶肉细胞叶肉细胞细胞核细胞核活细胞及细胞核活细胞及细胞核叶绿体叶绿体绘图参考绘图参考提示：下次实验为提示：下次实验为实验五实验五 细胞膜的通透性细胞膜的通透性实验六实验六 细胞凝集反应细胞凝集反应