荧光定量PCR技术.pptx

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1、1传统的临床微生物检测方传统的临床微生物检测方传统的临床微生物检测方传统的临床微生物检测方法法法法 细菌涂片细菌涂片 细菌培养细菌培养 免疫学技术免疫学技术 分别存在检出率低、周期长、特异性差的缺点。第1页/共37页2普通普通普通普通PCRPCR临床检测技术的缺临床检测技术的缺临床检测技术的缺临床检测技术的缺点点点点普通PCRPCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。因此国家卫生部曾在19971997年行文禁止将普通PCRPCR技术用于临床诊断。第2页/共37页3FQ-PCR与普通PCR的区别 采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用dUTP-U

2、NG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不产生污染。避免了假阳性。探针与被检DNA序列特异杂交，增强了特异性。第3页/共37页4FQ-PCR与普通与普通PCR的区别的区别可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情况。光谱分析仪直读结果，自动分析，增强了灵敏性和客观性。第4页/共37页5荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCRPCR技术技术 随着PCR技术的日臻成熟，已出现的荧光基因探针杂交定量PCR方法把目的基因扩增、特异分子杂交和荧光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对扩增产物进行实时动态检测和结果的自动分

3、析。第5页/共37页6荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCRPCR技术技术 不仅进一步提高了特异性，并从根本上解决了PCR扩增产物污染的难题，保持了PCR技术的快速和高灵敏性，使假阳性率和假阴性率降低到最低限度，而且能定量被检微生物的核酸拷贝数，为临床实践提供准确的病原微生物的诊断、提供评估药物临床治疗效果的可靠依据。因此，荧光基因探针杂交定量PCR技术诊断病原微生物与迄今本院各临床科室所进行的临床检测技术不相重复，它是一种属不同层次、快速、准确、直接并具有不同临床指导意义的检测方法。第6页/共37页7荧光定量聚合酶链反应荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCRFluorescence qu

4、antitative PCR）一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的定量PCR方法 PCR的高效扩增特性 核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性第7页/共37页8荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCRPCR 技术与临床技术与临床技术与临床技术与临床 在确保特异性的前题下，高质的灵敏性使得PCR技术能探测到疾病发展的初期阶段，甚至于临床症状出现前或亚临床状态或机体正在向病态发展的早期过程之中，如对于感染性疾病，以往的方法要么间接的检查机体免疫系统对侵入微生物的反应产物降解产物（如抗原）或直接检查侵入微生物（如培养，镜检），但上述

5、方法的灵敏度都受到方法学上的限制而达不到检查极微量级（如Pg水平），因而难以在早期对疾病的发生做出准确，客观的诊断，但PCR巨大的放大效率却解决了这一问题。第8页/共37页9荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCR技术与临床技术与临床另外如对像肿瘤等“渐变性”疾病是因多基因积累性突变才能造成正常细胞转变成癌细胞的，那么及时检测到突变由量变转化为质变前期阶段则显得极为重要，只有基因诊断才能完成这一目标。第9页/共37页10荧光定量PCR检测的对象是致病的病因，所以对于鉴别疾病的致病因子非常实用和准确，这对于区别相近临床症状的不同致病子，以期对因治疗极为有用。荧光定量PCR可以对致病因子进行

6、准确的定量，对治疗前后及治疗过程进行量化监控，则可以有效的观察药物治疗效果。如果用致病子的数量多少表示治疗效果，则可以进行临床治疗方案的评价及治愈标准的确立。第10页/共37页11荧光定量PCR检测的临床应用范围用于疾病的早期诊断用于疾病的鉴别诊断用于疾病的病因确定用于药物疗效的评价用于治疗效果的评价用于治愈标准的确定第11页/共37页12荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR技术应用于技术应用于技术应用于技术应用于感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断第12页/共37页13结核杆菌的临床诊断方法结核杆菌的临床诊断方法目前结核病确诊主要依靠痰片染色，抗酸杆菌和结

7、核杆菌的培养法鉴定。但涂片阳性率不高，且不能确诊；培养法需较长时间。ELISA和RIA法敏感性低，尚不能直接检测临床标本。近年来国外出现了培养早期进行放射性检测的BacTec技术，能显著缩短报告时间，但价格极贵，国内很难推广。基因诊断技术的应用是一大突破，其中包括基因探针技术，染色体指纹技术和荧光定量PCR技术。第13页/共37页14 .北京胸科医院;北京市结核病胸部肿瘤研究所;上海肺科医院三家医院的考核情况。1.三家医院标本分布医院 结核组351例 对照组160例 例数 涂阳 培阳北京胸科143364260北京结研所151403150上海肺科57572950结核分枝杆菌(TB)TB)FQ-P

8、CRFQ-PCR检测与常规检测比较第14页/共37页15 FQ-FQ-PCRPCR法与涂片法、培养法的检出率比较组别 涂片法 培养法 FQ-PCRFQ-PCR法 例数 阳性 检出率 阳性 检出率 阳性 检出率结核病组 351 133 37.9%102 29.1%220 351 133 37.9%102 29.1%220 62.7%62.7%对照组 160 0 0%0 0%0 160 0 0%0 0%0 0%0%第15页/共37页16荧光定量PCR技术检测结核杆菌应用评价1.特异性 人型结核杆菌，牛型结核杆菌及卡介菌均可扩增检测出，其它分支杆菌均否。2.敏感性 可检测1pg DNA，其相当于30

9、个结核杆菌的染色体DNA量。3.临床应用 快速 可检测无法培养的结核杆菌第16页/共37页17临床上，结核性脑膜炎是小儿多发病，病情凶险，所以早期快速诊断具有重要意义，而荧光定量PCR方法整个过程才45小时，远较细胞培养法为快，而且准确。检测标本无特殊限制：痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌洗液、脑脊液、分泌物等均可送检第17页/共37页18荧光定量荧光定量PCRPCR检测淋球菌检测淋球菌淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要是进行实验室检查。传统的方法有涂片染色法，分离培养法和用来检测淋球菌抗原的EIA-Gonozyme系统法。近年来，荧光定量PCR诊断技术的应用，使淋病的快速诊断有重大突

10、破。荧光定量PCR方法适用于淋病的快速诊断和流行病学调查。第18页/共37页19乙型、丙型肝炎病毒的乙型、丙型肝炎病毒的PCR检测检测 第19页/共37页20HBV感染的诊断主要采用免疫测定法检测血清标本中的HBSAg，HbeAg，抗抗-Hbs，抗抗-HBc和抗和抗-Hbe（两对半），免疫学方法虽然比较简单，但只能提供血清中的HBV间接证据，无法证明是否具有传染性，而且敏感性较低。而内源性DNA聚合酶法和斑点杂交分析法则可直接确定临床标本中HBV DNA的存在。尽管比较敏感，但只能检测到0.1pg的HBV DNA。而荧光定量PCR方法则可检测到200copy/ml的HBV DNA，因而是极为有

11、用的方法。第20页/共37页21肝炎病毒的肝炎病毒的PCR检测的意义检测的意义PCRPCR方法可检出杂交法测定阴性而具有不同HBVHBV血清学标志的血清标本中的HBV HBV DNADNA。PCRPCR方法可检出HBs AgHBs Ag阳性而Hbe AgHbe Ag阴性携带者的HBV DNAHBV DNA。PCRPCR方法可检出慢性HBVHBV感染 干扰素治疗后转阴的患者 血清中残存的HBV DNAHBV DNA。第21页/共37页22丙型肝炎病毒的丙型肝炎病毒的丙型肝炎病毒的丙型肝炎病毒的 PCRPCR 检测检测检测检测 丙型肝炎多由输血或血液制备引起,临床预后较差,死亡率高,所以早期诊断具

12、有非常重要的意义.目前最为敏感和特异的方法,属荧光基因杂交定量PCR方法。第22页/共37页23应用评价应用评价PCR法是检测病毒血症(HCV RNA)的最敏感方法。PCR方法克服了抗体测定法之不足,通过扩增核酸达到检测病毒的目的.PCR法可用来区分活动性HCV和急性期的消退性感染,后者与病毒RNA的消失有关。血清转化期,PCR法也可检出HCV RNA存在。对非甲非乙肝炎患者,PCR方法对肝活检组织HCV RNA有很高的检出率。第23页/共37页24肝炎病毒的肝炎病毒的PCR检测的意义检测的意义HBV及及HCV的的PCR检测检测确诊对手术相关科室待手术病人十分重要。明确术前病人是否具有传染性，

13、对术中医务人员的自身保护、术后病人敷料及分泌物的正确处理以防止院内交叉感染，并避免因术前、术后诊断不明确引起的医疗纠纷都具有直接的指导意义。因此，建议手术相关科室从以上诸方面考虑，常规进行HBV、HCV荧光基因杂交定量PCR检测。也建议其他科室对相关病人进行检测。第24页/共37页25人类巨细胞病毒人类巨细胞病毒人类巨细胞病毒人类巨细胞病毒(HCMV)HCMV)HCMV)HCMV)的的的的 PCRPCRPCRPCR检测检测检测检测 巨细胞病毒(CMV)为疱疹病毒科成员，其基因组由一240kb的线性双股DNA分子组成，人类巨细胞病毒对人的感染很普遍，有时感染是致死性的。这种病毒也是引起人类先天性

14、畸形的一个重要原因，所以建立快速敏感的诊断方法甚为重要。第25页/共37页26一、人类巨细胞病毒(HCMV)的诊断方法快速细胞培养技术LISA法分子杂交法PCR方法第26页/共37页27快速细胞培养技术敏感性低。ELISA法除敏感性不高外，还易受干扰因素的影响。探针杂交检测DNA法，对标本的处理及制备较麻烦；而且只有当细胞中CMV的拷贝数很高时，该方法的敏感性才可提高。随着对CMV基因组序列的阐明，PCR技术在CMV的检测方面已成为最准确的方法。第27页/共37页28用用PCR检测衣原体检测衣原体DNA 衣原体属包括3个种，分为：沙眼衣原体(引起眼部疾病和性传播疾病)鹦鹉热衣原体(引起呼吸道疾

15、病)肺炎衣原体 (引起肺炎)第28页/共37页29 沙眼衣原体 不仅可致眼部疾病，也是性传播疾病的主要病原体。鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体 在人类则主要引起呼吸道疾病。然而衣原体感染常缺乏特异症状，使临床诊断和监控甚为困难。选择衣原体保守的16SrRNA基因为模板，应用PCR技术则可以敏感，特异和简便地进行诊断。第29页/共37页30应用前景应用前景PCR技术适于：沙眼衣原体生殖泌尿道感染的早期诊断，尤其适于对无症状携带者或轻症患者的诊断。根据采集标本的部位不同，检测其它衣原体的感染。作衣原体感染的分子流行病学调查.为性传播疾病的监控提供依据。第30页/共37页31第三军医大学基因诊断中心第三军医

16、大学基因诊断中心附属于西南医院综合实验研究中心，位于西南医院科教楼4 4楼是重庆市首家引进美国BIO-RAD BIO-RAD 公司的“iCycleriCycler”荧光定量PCRPCR检测仪和PEPE公司377377型全自动DNADNA测序仪的实验室。能准确、及时地为临床在 基因水平提供肝炎、性病 、结核、HIV HIV 等病原体感 染 的定量分析及疗效评估。第31页/共37页32第三军医大学基因诊断中心第三军医大学基因诊断中心现所开展的检测项目现所开展的检测项目乙肝病毒乙肝病毒（HBV）荧光定量荧光定量PCR检测检测 丙肝病毒丙肝病毒（HCV）荧光定量荧光定量PCR检测检测淋球菌淋球菌（NG

17、）荧光定量荧光定量PCR检测检测沙眼衣原体（沙眼衣原体（CT）荧光定量荧光定量PCR检测检测解脲支原体（解脲支原体（UU）荧光定量荧光定量PCR检测检测结核分支杆菌（结核分支杆菌（TB）荧光定量荧光定量PCR检测检测第32页/共37页33单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（HSV）荧光定量荧光定量PCR检测检测人类巨细胞病毒人类巨细胞病毒（CMV）荧光定量荧光定量PCR检测检测人人乳乳头头瘤瘤病病毒毒6 型型（HPV 6型型）荧荧光光定定量量PCR检检测测人人乳乳头头瘤瘤病病毒毒11型型（HPV 11型型）荧荧光光定定量量PCR检检测测人人乳乳头头瘤瘤病病毒毒16型型（HPV 16型型）荧荧光光定定量量PCR检检测测人人乳乳头头瘤瘤病病毒毒18型型（HPV 18型型）荧荧光光定定量量PCR检检测测梅毒螺旋体（梅毒螺旋体（TP）荧光定量荧光定量PCR检测检测肺炎支原体（肺炎支原体（MP）荧光定量荧光定量PCR检测检测EB病毒（病毒（EBV）荧光定量荧光定量PCR检测检测第33页/共37页34精品课件！第34页/共37页35精品课件！第35页/共37页36谢谢谢谢 谢谢谢谢!01-3-30第36页/共37页37感谢您的观看！第37页/共37页