三提取和分离.pptx

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1、三提取和分离三提取和分离学习内容：制备细胞总制备细胞总DNADNAl l培养、搜集细菌细胞培养、搜集细菌细胞l l制备细胞提取物制备细胞提取物l lDNADNA纯化、浓缩纯化、浓缩l l从其他生物中提取总从其他生物中提取总DNADNA质粒质粒DNADNA提取提取l l根据分子大小分离根据分子大小分离l l根据结构分离根据结构分离l l质粒扩增质粒扩增提取噬菌体提取噬菌体DNADNAl l噬菌体的培养噬菌体的培养l l制备非溶源性噬菌体制备非溶源性噬菌体l l收集噬菌体收集噬菌体l l从从 噬菌体中纯化噬菌体中纯化DNA DNA l l纯化纯化M13 DNA M13 DNA 第1页/共41页Fi

2、gure3.1 The basic steps in preparation of total cell DNA from a culture of bacteriaBasic Steps第2页/共41页1.制备总DNA基本步骤：1)收集细菌细胞2)打碎细胞，释放内容物3)去掉DNA以外的成分4)DNA溶液的浓缩第3页/共41页1.1培养、搜集细菌细胞两种类型的细菌培养基的成分：M9培养基：Na2HPO4(6.0)KH2PO4(3.0)NaCl(0.5)NH4Cl(1.0)MgSO4(0.5)Glucose(2.0)CaCl2(0.015)LB培养基：Yeast extract(5)NaCl(

3、10)第4页/共41页1.1培养、收集细菌细胞37C，150-250rpm达到最大浓度2-3109cell/ml,600nm下的OD值，1OD相当于0.8109cell/ml Figure3.2 Estimation of bacterial cell number by measurement of optical density第5页/共41页Figure3.3 Harvesting bacteria by centrifugation第6页/共41页1.2 制备细胞提取物利用溶菌酶、利用溶菌酶、EDTAEDTA或两者结合。或两者结合。l l溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分溶菌酶是存在于

4、蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，消化多聚物。泌物中，消化多聚物。l lEDTAEDTA络合保持细胞结构完整的镁离子，络合保持细胞结构完整的镁离子，也可以抑制细胞中降解也可以抑制细胞中降解DNADNA酶的活性。酶的活性。l l一般溶菌酶或一般溶菌酶或EDTAEDTA足以破坏细菌细胞，足以破坏细菌细胞，在提取液中同时还加入在提取液中同时还加入SDSSDS。第7页/共41页Figure3.4 Preparation of a cell extract.Preparation of a cell extractPreparation of a cell extract第8页/共41页Figure3.5 R

5、emoval of protein contaminants by phenol extraction.Purification of DNA from a cell extractPurification of DNA from a cell extract第9页/共41页1.制备细胞总DNA1.4 DNA的浓缩与浓度测定最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀。260nm下测定吸光度，1OD相当于50g双链DNA/ml。A260/A280=1.8，2说明有RNA第10页/共41页Figure3.6 Collecting DNA by ethanol

6、 precipitation.Concentration of DNA samples Concentration of DNA samples 第11页/共41页Figure3.7 The CTAB method for purification of plant DNA Plant DNA(CTABPlant DNA(CTAB法法法法)十六烷基十六烷基三甲基溴三甲基溴化铵化铵第12页/共41页Figure3.8 The use of an anion-exchange chromatography resin in DNA purification.阴离子交换层析法阴离子交换层析法阴离子交

7、换层析法阴离子交换层析法第13页/共41页2 质粒DNA提取质粒DNA的大小（8%）。DNA的构造 Alkaline denaturation Ethidium bromide（溴化（溴化二氨乙苯啡啶）二氨乙苯啡啶）-caesium chloride（氯化铯）（氯化铯）density gradient centrifugation第14页/共41页2质粒DNA提取2.1 根据分子大小提取质粒DNAsphaeroplasts裂解细胞可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整。问题：l l裂解液中不可避免的包含一些染色体裂解液中不可避免的包含一些染色体DNADNAl l质粒分子非常大时质粒分子非常大时

8、 ，将与染色体，将与染色体DNADNA共沉淀共沉淀第15页/共41页Figure3.9 Preparation of a cleared lysatelysate.Sphaeroplast残壁细胞残壁细胞第16页/共41页2质粒DNA提取2.2 根据分子构造提取碱裂解法 基本原理：在非常窄的基本原理：在非常窄的pHpH范围内，非螺旋化的范围内，非螺旋化的DNADNA会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解液中加入氢氧化钠，调液中加入氢氧化钠，调pHpH值至值至12.012.5,12.012.5,破坏破坏氢键，使氢键，使DNADNA变性。加入酸，变性的细菌变性。加

9、入酸，变性的细菌DNADNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。另外一个优点，利用另外一个优点，利用SDSSDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（Sodium dodecyl sulfateSodium dodecyl sulfate，SDSSDS），裂解，），裂解，KAcKAc中和可以去掉大部分的蛋白质和中和可以去掉大部分的蛋白质和RNARNA。第17页/共41页Figure3.10 Two conformation of circular double-stranded DNA.Two conformation of circular dou

10、ble-stranded DNATwo conformation of circular double-stranded DNA第18页/共41页Figure3.11 Plasmid purification by the alkaline denaturation method.Alkaline denaturation第19页/共41页2质粒DNA提取2.2 EBCsCl密度梯度离心法在大离心力条件下，形成梯度，生物在大离心力条件下，形成梯度，生物大分子形成条带。条带的位置取决于大分子形成条带。条带的位置取决于其浮力密度。最上部是蛋白质，中间其浮力密度。最上部是蛋白质，中间是是DNADNA

11、，下部是，下部是RNARNA。第20页/共41页Figure3.12 CsCl density gradient centrifugation.CsCl density gradient centrifugation第21页/共41页2.2 EBCsCl密度梯度离心法EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。第22页/共41页Figure3.13 Partial unwinding of the DNA double helix by EtBr intercalatio

12、n between adjacent base parirs.EBEB如何与如何与DNA结合结合?第23页/共41页Figure3.14Purification of plasmiod DNA by EtBr-CsCl density gradient centrifugation如何分离质粒如何分离质粒DNA？第24页/共41页2质粒DNA提取2.3 2.3 质粒扩增质粒扩增 一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。当细胞增加到条件下复制的能力。当细胞增加到足够数目时，加入蛋白合成抑制剂足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如如氯霉素氯霉素，继续培养。在这个过程

13、，继续培养。在这个过程中，质粒分子继续复制，但染色体中，质粒分子继续复制，但染色体的复制和细胞分裂已经停止，可以的复制和细胞分裂已经停止，可以获得上千个拷贝。获得上千个拷贝。第25页/共41页Figure3.15 Plasmid amplification Plasmid amplificationInhibitor of protein synthesis:Chloramphenical,12h,第26页/共41页3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白就可以获得噬菌体DNA。然而获得大量的噬菌体DNA是一个障碍。每ml菌液可以获得1010

14、噬菌体，但只能产生500ngDNA。第27页/共41页3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备3.1 噬菌体的培养自然培养的噬菌体是溶源性的。要获得大量的细胞外噬菌体，必须经过诱导培养使所有的噬菌体都进入裂解周期，使细胞死亡释放噬菌体。第28页/共41页3.1 噬菌体的培养大部分实验室都使用大部分实验室都使用c cI I突变的温度敏感突变体。突变的温度敏感突变体。c cI I基因可以使噬菌体保持整合状态，突变后转变成溶基因可以使噬菌体保持整合状态，突变后转变成溶菌性的。在菌性的。在c cI Itsts突变体中，突变体中，c cI I基因在基因在30C30C条件下正条件下正常表达，在常表达，在42C4

15、2C时，不能正常表达，产生溶菌性。时，不能正常表达，产生溶菌性。第29页/共41页Figure3.17 Induction of a clts lysogen（溶原菌）（溶原菌）by transferring from 30 to 42Lysogenic phageLysogenic phageAt 30 At 30,clts gene,clts gene protein works,Keep protein works,Keep lysogenylysogeny（溶原性）（溶原性）（溶原性）（溶原性）:At 42 At 42,clts gene,clts gene protein does

16、not protein does not work,produce work,produce extracellular phageextracellular phage（细胞外抗菌素）（细胞外抗菌素）（细胞外抗菌素）（细胞外抗菌素）.第30页/共41页Figure3.18 Achieving the right balance between culture age and inoculum size when preparing a sample of a non-lysogenic phageNon-Non-lysogenic lysogenic phage phage（Lytic)Ly

17、tic)由于缺失修饰，大由于缺失修饰，大多数基因工程载体多数基因工程载体属于此类型。属于此类型。第31页/共41页3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备3.3 收集噬菌体 噬菌体颗粒非常小，所以只有高速离心才能沉淀。通常利用PEG沉淀病毒颗粒，形成多聚体。离心可以收集噬菌体，重新溶解在少量的溶液中。第32页/共41页3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备3.4 从噬菌体中纯化DNA PEGPEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂解物，也可能沉淀物中可能含有少量的细菌裂解物，也可能含有细菌含有细菌DNADNA。这些组成部分可以通过梯度离心去。这些组成部分可以通过梯度离心去掉。除去掉。除去CsClCsCl后可以

18、获得纯净的后可以获得纯净的 噬菌体。然后通噬菌体。然后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质外壳。过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质外壳。第33页/共41页Figure3.19 Collection of phage particles by polyethylene（聚（聚乙烯）乙烯）glycol（乙二醇）（乙二醇）(PEG)precipitation Collection of phage particlesCollection of phage particles第34页/共41页Purification Purification of phageof phageFigure3.20 Purifica

19、tion of phage particles by CsCl density gradient centrifugation.第35页/共41页第36页/共41页3.5 纯化M13 DNA 每每mlml菌液可以获得菌液可以获得10101212的噬菌体。这意味着少量的的噬菌体。这意味着少量的培养物可以获得大量的噬菌体，如培养物可以获得大量的噬菌体，如5ml5ml或更少。或更少。由于细菌细胞不裂解，没有细胞裂解物的问题，也由于细菌细胞不裂解，没有细胞裂解物的问题，也不需要不需要CsClCsCl梯度离心。梯度离心。第37页/共41页Figure3.21 Preparation of M13 DNA from an infected culture of bacteria.PreparationPreparationof M13 DNAof M13 DNANext chapNext Chap第38页/共41页中国基因工程研究进展中国基因工程研究进展*The end！Thanks！第39页/共41页测验一根据你的理解，回答以下三个问题。1、什么是基因工程技术？基因工程的意义何在？2、简要说明基因工程研究的基本步骤？3、谈谈你对基因工程技术未来的发展趋势及构想。第40页/共41页感谢您的观看。感谢您的观看。第41页/共41页