质粒DNA的提取学习.pptx

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1、实验目的实验目的|掌握质粒抽提的目的掌握质粒抽提的目的|了解质粒抽提原理了解质粒抽提原理|熟悉质粒抽提方法熟悉质粒抽提方法第1页/共21页一、实验原理一、实验原理|理论基础：理论基础：宿主染色体宿主染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA的区别的区别|实验操作原理：三个基本步骤实验操作原理：三个基本步骤 X 细菌培养细菌培养X 裂解细菌以及质粒的初步分离裂解细菌以及质粒的初步分离X 质粒质粒DNADNA的纯化的纯化第2页/共21页理论基础理论基础|细菌质粒是一类双链闭环的小分子细菌质粒是一类双链闭环的小分子DNADNA，独立于细菌染色体之外，能够进行自我复，独立于细菌染色体之外，能够进行自我

2、复制。质粒作为载体广泛应用于目的基因的克隆、测序、表达等工作。制。质粒作为载体广泛应用于目的基因的克隆、测序、表达等工作。第3页/共21页宿主染色体宿主染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA主要区别：主要区别：宿主染色体宿主染色体DNA质粒质粒DNA分子大小分子大小分子大分子大分子小分子小抽提结果抽提结果断裂成为线状断裂成为线状共价闭合环状结构共价闭合环状结构第4页/共21页实验操作原理实验操作原理分离质粒分离质粒DNADNA包括包括3 3个基本步骤：个基本步骤：第5页/共21页 培养细菌培养细菌 在含有相应抗性的液体培养基中培养已转染质粒的细菌，使细菌快速增殖的同时在含有相应抗性的液体培

3、养基中培养已转染质粒的细菌，使细菌快速增殖的同时质粒质粒DNADNA得到大量扩增。目前常用的质粒均具有很高的拷贝数。得到大量扩增。目前常用的质粒均具有很高的拷贝数。37oC振荡过夜第6页/共21页 裂解细菌以及质粒的初步分离裂解细菌以及质粒的初步分离 最普遍采用的方法是最普遍采用的方法是SDS-碱裂解法碱裂解法。将细菌培养物离心并以缓冲液悬浮，加入。将细菌培养物离心并以缓冲液悬浮，加入SDSSDS溶溶液破坏细胞，再加入钾离子沉淀液破坏细胞，再加入钾离子沉淀SDSSDS与大分子与大分子DNADNA并离心去除，小分子的质粒并离心去除，小分子的质粒DNADNA即处即处于上清液中。于上清液中。细菌沉淀

4、SDS-碱变性质粒DNA变性染色体DNA、蛋白质酸、钾上清复性的质粒DNA沉淀的变性染色体DNA、蛋白质进一步纯化第7页/共21页（3 3）获取高纯度质粒）获取高纯度质粒DNADNA的方法的方法|密度梯度离心密度梯度离心 CsCl CsCl密度梯度离心是最经典的方法，可获得高纯密度梯度离心是最经典的方法，可获得高纯度质粒度质粒DNADNA，但繁琐费时。，但繁琐费时。|离子交换层析离子交换层析 DEAE DEAE离子交换层析利用离子交换层析利用DNADNA、RNARNA及蛋白质与及蛋白质与DEAEDEAE基团间电荷作用的强弱差别分离，基团间电荷作用的强弱差别分离，|吸附层析法吸附层析法 玻璃珠吸

5、附层析利用玻璃珠吸附层析利用DNADNA在高盐浓度条件下与细在高盐浓度条件下与细小玻璃珠的特异性吸附作用进行分离。小玻璃珠的特异性吸附作用进行分离。第8页/共21页纯化的质粒纯化的质粒DNADNA有三种存在形式有三种存在形式|共价闭环共价闭环DNADNA，即超螺旋形式；，即超螺旋形式；|开开环环DNA,DNA,即即质质粒粒DNADNA的的两两条条链链中中有有一一条条发发 生生一一处处或或多多处处断断裂裂，因因此此可可以以自自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；|线状线状DNADNA，因质粒，因质粒DNADNA的两条链在同一处断裂而造成。的两条链在同一

6、处断裂而造成。第9页/共21页质粒电泳示意图质粒电泳示意图 Best better not good点样孔开环线状双螺旋双螺旋第10页/共21页吸附层析法纯化质粒吸附层析法纯化质粒DNADNA|质粒的快速抽提质粒的快速抽提X溶溶液液I I含含有有RNARNA酶酶，水水解解RNARNA，并并为为低低渗渗溶溶液液，但但由于细菌有细胞壁，因此不会破裂。由于细菌有细胞壁，因此不会破裂。X溶溶液液中中的的SDSSDS具具有有强强烈烈的的破破细细胞胞作作用用，使使基基因因组组DNADNA释放释放X溶液溶液使基因组使基因组DNADNA与与SDSSDS及钾离子结合形成沉淀。及钾离子结合形成沉淀。X将将含含有有

7、质质粒粒的的上上清清加加入入到到层层析析柱柱中中，利利用用玻玻璃璃珠珠吸附层析分离质粒。吸附层析分离质粒。第11页/共21页1.取 1-5 ml 过夜培养的菌液，加入离心管中，9000 rpm，30s，尽量吸除上清。2.向留有菌体沉淀的离心管中加入 250 l 溶液 P1。使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。3.向离心管中加入 250 l 溶液 P2，温和地上下翻转 68 次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组 DNA，造成提取的质粒中混有基因组 DNA 片断。4.向离心管中加入 350 l 溶液 P3，立即温和地上下翻转 68 次，充分混匀，13,000 rpm

8、，10 分钟。5.将上清液转移到吸附柱 AC 中，13,000 rpm，1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 放回收集管中。6.向吸附柱 中加入 700 l 漂洗液 WB，12,000 rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 放回收集管中。（洗去高盐）5.三、质粒抽提操作步骤三、质粒抽提操作步骤第12页/共21页7.向吸附柱 中加入 500 l 漂洗液 WB，12,000 rpm，30s，倒掉收集管中的废液。8.将吸附柱 放入收集管中,13,000，离心 2 分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留

9、乙醇的影响，将吸附柱 CP3 开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。9.将吸附柱 CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50l 洗脱H2O，室温放置 2 分钟，12,000 ，1 分钟将质粒溶液收集到离心管中。10.重复步骤 9。注意：洗脱液的 pH 值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用去离子水做洗脱液，并保证其 pH值在 7.0-8.5 范围内(可以用 NaOH 将水的 pH 值调到此范围)，pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率。且 DNA 产物应保存在-20，以防 DNA 降解。续质粒抽提步骤续质粒抽提步骤第13页/共21页琼脂糖凝胶电泳检

10、测琼脂糖凝胶电泳检测|制备制备1 1琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶:凝胶浓度决定孔径大小，应依据样品凝胶浓度决定孔径大小，应依据样品DNADNA分子长度调整。分子长度调整。溴乙锭是溴乙锭是DNADNA嵌合剂，与嵌合剂，与DNADNA结合后经紫外光照射发出结合后经紫外光照射发出橙色荧光。橙色荧光。|DNADNA溶液上样。溶液上样。DNA DNA上样量以观察到清晰条带为宜。一般每个样品孔上样量以观察到清晰条带为宜。一般每个样品孔100ng100ng为宜。加样过多造成电泳条带形变、拖尾和扩散。为宜。加样过多造成电泳条带形变、拖尾和扩散。加样量越少分离效果越好，但溴乙锭的检出灵敏度有限，加样量越少分离效果越好，

11、但溴乙锭的检出灵敏度有限，单一条带的检测低限是单一条带的检测低限是2ng2ng左右。左右。|电泳。电泳。在在1 1琼脂糖中，溴酚蓝的泳动速度相当于琼脂糖中，溴酚蓝的泳动速度相当于300bp300bp左右左右DNADNA片段。根据样品中片段。根据样品中DNADNA片段大小，注意指示剂泳动位片段大小，注意指示剂泳动位置。置。|紫外灯下观察结果。紫外灯下观察结果。紫外灯有长波与短波两种类型。短波紫外灯有长波与短波两种类型。短波(254nm)(254nm)激发的荧激发的荧光强度高，对光强度高，对DNADNA损伤较大。长波损伤较大。长波(302nm)(302nm)激发的荧光激发的荧光较低，但对较低，但对

12、DNADNA损伤较小。市售的紫外灯多数是长波型。损伤较小。市售的紫外灯多数是长波型。第14页/共21页电泳步骤电泳步骤X制备制备1 1琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶:用用1TBE1TBE电电泳泳缓缓冲冲液液配配制制1%1%琼琼脂脂糖糖溶溶液液，微微波波炉炉中中加加热热至至溶溶化化（2min2min）。稍稍等等微微凉凉，加加溴溴乙乙锭锭2 2 u ul l，混匀并灌制事先备好的凝胶板。，混匀并灌制事先备好的凝胶板。X点样：点样：取质粒取质粒DNADNA溶液溶液5 5l l、上样缓冲液、上样缓冲液1 1l l，混匀，混匀，上样。上样。X电泳电泳 150V 150V电泳电泳3030分钟，至指示剂泳动至凝胶前缘

13、时停分钟，至指示剂泳动至凝胶前缘时停止电泳。止电泳。X紫外灯下观察结果。紫外灯下观察结果。第15页/共21页四、操作注意事项四、操作注意事项|加入溶液加入溶液、时轻缓颠倒混匀，以免基因组时轻缓颠倒混匀，以免基因组DNADNA断裂，造成质粒污染。断裂，造成质粒污染。|溴乙锭具有极强的致突变能力，使用时需谨慎。溴乙锭具有极强的致突变能力，使用时需谨慎。|由于紫外线可造成视网膜严重损伤，因此不可用肉眼直接观察紫外灯。由于紫外线可造成视网膜严重损伤，因此不可用肉眼直接观察紫外灯。第16页/共21页Backup第17页/共21页三、质粒抽提操作步骤三、质粒抽提操作步骤|用用接接种种棒棒取取含含有有质质粒

14、粒的的大大肠肠杆杆菌菌接接种种于于5ml5ml含含有有抗菌素的抗菌素的LBLB培养液，培养液，3737振荡培养过夜（已备）。振荡培养过夜（已备）。|取取1.5ml1.5ml过过夜夜培培养养物物，加加入入1.5ml1.5ml离离心心管管中中，3000rpm3000rpm离心离心10min10min，弃上清液。，弃上清液。|加入加入250l250l溶液溶液，旋涡混匀，静置，旋涡混匀，静置5 min5 min。|加加入入新新鲜鲜配配制制的的溶溶液液250l250l并并轻轻微微颠颠倒倒混混匀匀6-86-8次。次。在在进进行行混混匀匀时时不不可可振振荡荡，以以免免基基因因组组DNADNA断断裂裂，对质粒

15、的纯化造成污染。对质粒的纯化造成污染。|加入溶液加入溶液 250l 250l并轻微微颠倒混匀并轻微微颠倒混匀6-86-8次。次。|离离心心13000rpm10min13000rpm10min，吸吸取取上上清清液液0.6 0.6 mlml，收收集于一个新离心管中。集于一个新离心管中。第18页/共21页续质粒抽提步骤续质粒抽提步骤|加入加入6M6M异硫氰酸胍异硫氰酸胍120l120l，混匀。，混匀。|将混合液加入放在套管的层析柱内，离心将混合液加入放在套管的层析柱内，离心10000rpm2min10000rpm2min。|弃流出液，加入弃流出液，加入80%80%乙醇乙醇750l750l，离心，离心

16、3000rpm2min3000rpm2min。|弃流出液，离心弃流出液，离心10000rpm2min10000rpm2min。|将层析柱换入将层析柱换入1.5ml1.5ml新离心管，加入新离心管，加入H H2 2O 40lO 40l，静置，静置1min1min。|离心离心10000rpm2min10000rpm2min，收集流出液。，收集流出液。第19页/共21页四、琼脂糖凝胶电泳检测四、琼脂糖凝胶电泳检测|制备琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶(几十几十bp-几百几百kb):):凝胶浓度决定孔径大小，依据凝胶浓度决定孔径大小，依据DNA分子大小调整。分子大小调整。溴化乙锭溴化乙锭(EB)是是DNA嵌合

17、剂，经紫外光照射发出嵌合剂，经紫外光照射发出橙色橙色荧光荧光。|DNA溶液上样溶液上样:100-500ng/样品孔样品孔为宜。加样过多造成电泳条带形变、为宜。加样过多造成电泳条带形变、拖尾和扩散。加样量越少分离效果越好，溴乙锭单一条拖尾和扩散。加样量越少分离效果越好，溴乙锭单一条带的检测低限是带的检测低限是2ng2ng左右。左右。|电泳电泳:在琼脂糖中，溴酚蓝的泳动速度相当于在琼脂糖中，溴酚蓝的泳动速度相当于300bp左右左右DNA片段。根据样品中片段。根据样品中DNA片段大小，注意指示剂泳动位置。片段大小，注意指示剂泳动位置。指示电泳时间。指示电泳时间。|紫外灯下观察结果。紫外灯下观察结果。紫外灯有长波与短波两种类型。短波紫外灯有长波与短波两种类型。短波(254nm)激发的荧激发的荧光强度高，光强度高，对对DNADNA损伤较大损伤较大。长波。长波(302nm)激发的荧光激发的荧光较低，但对较低，但对DNA损伤较小。市售的紫外灯多数是损伤较小。市售的紫外灯多数是长波型长波型。第20页/共21页