质粒DNA提取酶切及浓检测.pptx

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1、质粒提取目的质粒提取目的PCR的模板质粒作为克隆载体(研究目的基因时，常需要提取质粒)第1页/共25页质粒提取的方法与原理质粒提取的方法与原理碱裂解法碱裂解法SDS裂解法煮沸裂解法氯化铯-溴化乙锭梯度离心法试剂盒法试剂盒法第2页/共25页碱裂解法碱裂解法溶液溶液1 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mMTris-HCl pH8.0。溶液溶液2 0.2mol/L NaOH,1%SDS溶液溶液3 乙酸钾溶液乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：60mL的的5mol/L KAc,11.5ml冰醋酸，冰醋酸，28.5mL H2O第3页/共25页1.培培养养细细菌菌：将将带带有

2、有质质粒粒的的大大肠肠杆杆菌菌接接种种到到1.5-3ml含含有有相相应应抗抗生生素素的的液液体体培培养养基基，37培养培养1216小时小时;2.取取液液体体培培养养液液1.5-3ml于于Eppendorf管管中中，10000r/min离离心心1min，去去掉掉上上清清液液，加加入入100 l溶液溶液13.充分混匀放置充分混匀放置3-5分钟分钟;4.加加入入200 l新新配配制制的的0.2mol/L NaOH+1SDS（变变性性液液），加加盖盖颠颠倒倒3-5次次使使之之混混匀匀，冰上放置冰上放置5min;质粒小量提取的方法（手工提取）：质粒小量提取的方法（手工提取）：第4页/共25页4.加入加入

3、150 l乙酸钾溶液乙酸钾溶液(溶液溶液III)，加盖后颠倒，加盖后颠倒3-5次混匀，次混匀，冰上放置5min;5.用台式高速离心机，用台式高速离心机，12000r/min离心离心15min，上清移入另一干净离心管，并加上清移入另一干净离心管，并加2倍倍 100乙乙醇混匀，醇混匀，12000r/min离心离心5min，弃去上清液，弃去上清液;6.沉淀用沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次，乙醇清洗一次，12000r/min离心离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥除尽乙醇，室温自然干燥;7.加入加入30-50 l含有含有20 g/ml

4、 RNase的灭菌蒸馏的灭菌蒸馏水或水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使，使DNA充分溶解充分溶解(有时需要酚有时需要酚:氯仿抽氯仿抽提提);8.将分离出的质粒将分离出的质粒DNA置于置于-20保存备用。保存备用。第5页/共25页注意：注意：用移液器操作时，每一步都要格用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液外小心，特别是在加入溶液II II 和和IIIIII后，一定不要剧烈振荡，以免后，一定不要剧烈振荡，以免切碎切碎DNA(DNA(包括质粒包括质粒DNADNA和基因组和基因组DNA)DNA)！第6页/共25页质粒小抽试剂盒质粒小抽试剂

5、盒 原理：把硅胶薄膜的优点与经典的碱-SDS裂解细菌细胞法结合起来。优点：操作简便、节约时间、性/价比高。第7页/共25页使用者需备使用者需备 10,000 xg以上高速离心机1.5ml的灭菌干净小离心管灭菌去离子水(或TE缓冲液)无水乙醇 第8页/共25页注意注意 一、使用前往准备好的SolutionI中加入RNase A，二、浓缩的Wash Buffer需用乙醇稀释：三、稀释后的DNA Wash Buffer需室温保存；四、所有步骤必须在室温下操作。第9页/共25页实验操作步骤实验操作步骤增殖细菌、扩增质粒裂解菌体、获取质粒抽提质粒、分离纯化结果鉴定第10页/共25页 对于未经酶切的质粒来

6、说，常会出现两条电泳带对于未经酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带 1 1）（松弛）螺旋状质粒）（松弛）螺旋状质粒DNADNA带带 2 2）超螺旋状质粒）超螺旋状质粒DNADNA的带的带以以超超螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA居居多多，移移动动速速度度也也最最快快。有有时时还还会会出出现现三三条条带带，其其中中一一条条是是因因为为有有一一些些质质粒粒DNADNA在在提提取取过过程程中中遭遭到到损损伤伤而而线线性性化化，其其移移动动速速度度介介于于螺螺旋旋状状和和超超螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA之之间间。如如果果提提取取的的质质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。粒很好时，这条带会很弱，有时看

7、不到。第11页/共25页质粒质粒DNA提取范例：提取范例：第12页/共25页 质粒质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定 第13页/共25页1.实验目的和要求实验目的和要求学习和掌握限制性内切酶的特性、酶学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解操作方法，并理解限制性内切酶是解操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。重组技术的关键工具。第14页/共25页2.相关基础知识相关基础知识 限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶：是是一一类类能能识识别别双双链链DNA分分子子特特异异性性核核酸酸序序列列的的DNA水水解解酶酶。是是体体外外剪剪切切基基因因片片段段的的重重要要工工具具，所所以以常常常常与与核核

8、酸酸聚聚合合酶酶、连连接接酶酶以以及及末末端端修修饰饰酶酶等等一一起起称称为为工工具具酶酶。限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶不不仅仅是是DNA重重组组中中重重要要的的工工具具，而而且且还还可可以以用用于于基基因因组组酶切图谱的鉴定。酶切图谱的鉴定。第15页/共25页1)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：断核酸的情况不同，分为三类：型型 型型*型型第16页/共25页IIII型型 限制性内切酶限制性内切酶 能能识识别别专专一一的的核核苷苷酸酸顺顺序序，并并在在该该顺顺序序内

9、内的的固固定定位位置置上上切切割割双双链链。由由于于这这类类限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别和和切切割割的的核核苷苷酸酸都都是是专专一一的的。因因此此，这这种种限限制制性性内内切切酶酶是是DNADNA重重组组技技术术中中最最常常用用的的工工具具酶酶之之一一。这这种种酶酶识识别别的的专专一一核核苷苷酸酸顺顺序序最最常常见的是见的是4 4个或个或6 6个核苷酸个核苷酸 II II 型型限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别顺顺序序是是一一个个回回文文对对称称顺顺序序，即即有有一一个个中中心心对对称称轴轴，从从这这个个轴轴朝朝二个方向二个方向“读读”都完全相同。都完全相同。第17页/共25页这种酶

10、的切割可以有两种方式：这种酶的切割可以有两种方式：粘粘性性末末端端；是是交交错错切切割割，结结果果形形成成两两条条单单链链末末端端，这这种种末末端端的的核核苷苷酸酸顺顺序序是是互互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如如EcoRIEcoRI的识别顺序为：的识别顺序为：5 5 GAA|TT_C GAA|TT_C 3 3 3 3 C_TT|AAG C_TT|AAG 5 5垂垂直直线线表表示示中中心心对对称称轴轴，从从两两侧侧“读读”核核苷苷酸酸顺顺序序都都是是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，这这就就是回文顺序（是回文顺序（palindrom

11、epalindrome）。）。_ _和和表示在双链上交错切割的位置表示在双链上交错切割的位置 第18页/共25页IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如上切割双链，产生平头末端。例如EcoEcoRV RV 的识别位置是：的识别位置是：5 5 GAT GAT|ATC|ATC 3 33 3 CTA CTA|TAG|TAG 5 5 这种末端同样可以通过这种末端同样可以通过DNADNA连接酶连接连接酶连接起来。起来。平头末端：平头末端：第19页/共25页2)影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1)DNA的纯度；的纯

12、度；(2)DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3)酶切消化反应的温度；酶切消化反应的温度；(4)DNA的分子结构；的分子结构；(5)溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类；(6)缓冲液的缓冲液的 pH值。值。第20页/共25页3.3.实验材料与仪器实验材料与仪器质粒质粒 标准分子量片段标准分子量片段(DNA Ladder)(DNA Ladder)EcoEcoRIRI 和和 Hind Hind 核酸内切酶（核酸内切酶（TakaraTakara）EcoRI和 Hind 酶解缓冲液酶解缓冲液(10M buffer)(10M buffer)琼脂糖琼脂糖TBETBE或或TAETAE缓冲液缓冲液(10

13、)(10)溴化乙啶染色液溴化乙啶染色液(10mg/ml)(10mg/ml)上样液上样液(6)(6)：0.25%0.25%溴酚兰，溴酚兰，4040(W/V)(W/V)蔗蔗糖糖 水溶液水溶液 。第21页/共25页 缓冲液缓冲液 因因为为不不同同的的酶酶所所要要求求的的最最适适反反应应条条件件不不同同，所所以以一一定定要要使使用用与与酶酶相相匹匹配配的的缓缓冲冲系系统统。一一般般按按照照销销售售酶酶的的公公司司所所提提供供的的相相应应缓缓冲冲液液。双双酶酶切切或或多多酶酶切切时时要要考考虑虑相相容容性性缓缓冲冲液液问问题题，一一般般公司会给用户提供这方面的信息。公司会给用户提供这方面的信息。EcoR

14、 I 酶切位点：酶切位点：GAATTCHind 酶切位点：酶切位点：AAGGCT第22页/共25页质粒量（质粒量（ngng）缓冲液缓冲液(ll)*)*EcoREcoR1 1（ll）Hind（ll）总体积总体积（ll）200(5200(5ll)1 10.50.50.50.51010*缓冲液随不同的酶而不同缓冲液随不同的酶而不同,本实验用本实验用 M bufferM buffer。置于置于3737水浴酶解水浴酶解0.5-10.5-1小时。酶解完成后，分别小时。酶解完成后，分别加入加入3 3 l l的上样缓冲液的上样缓冲液,然后进行电泳分析。然后进行电泳分析。1)质粒质粒DNA的酶解的酶解 4.实验方法和步骤实验方法和步骤 第23页/共25页实验结果实验结果 12 3 M 1 2 3 M 1 2 3 1.未酶切质粒；未酶切质粒；2.EcoRI 单酶切；单酶切；3.EcoR1+Hind 双酶双酶切切M.DNA Marker.第24页/共25页感谢您的观看！第25页/共25页