07 实验六 微生物菌种保藏技术.ppt

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1、实验七实验七 微生物菌种保藏技术微生物菌种保藏技术一、目的要求一、目的要求二、基本原理二、基本原理三、器材三、器材四、操作步骤四、操作步骤五、实验报告五、实验报告一、目的要求一、目的要求1、学习和掌握四大类微生物菌种保藏、学习和掌握四大类微生物菌种保藏的基本原理，比较几种不同的菌种保的基本原理，比较几种不同的菌种保藏方法。藏方法。二、基本原理二、基本原理 微生物个体微小、代谢活跃、生长微生物个体微小、代谢活跃、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异，繁殖快，如果保存不妥容易发生变异，被其他杂菌污染，甚至导致微生物细胞被其他杂菌污染，甚至导致微生物细胞死亡。微生物菌种的长期保藏对任何微死亡。微生物

2、菌种的长期保藏对任何微生物学工作者都是很重要的，也是非常生物学工作者都是很重要的，也是非常必要的。必要的。自自19世纪末世纪末F.Kral开始尝试微生物菌开始尝试微生物菌种保藏以来，已经建立了许多长期保藏种保藏以来，已经建立了许多长期保藏菌种的方法。虽不同的方法原理各异，菌种的方法。虽不同的方法原理各异，但基本原则是使微生物的新陈代谢处于但基本原则是使微生物的新陈代谢处于最低或几乎停止的状态。保藏方法通常最低或几乎停止的状态。保藏方法通常基于温度、水分、通气、营养和渗透压基于温度、水分、通气、营养和渗透压等方面的考虑。等方面的考虑。菌种保藏方法：菌种保藏方法：菌种保藏方法：菌种保藏方法：1 1

3、、传代培养法、传代培养法、传代培养法、传代培养法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于作保藏厌氧细菌用），培养后于作保藏厌氧细菌用），培养后于作保藏厌氧细菌用），培养后于4646冰箱内保存。冰箱内保存。冰箱内保存。冰箱内保存。2 2、悬液法、悬液法、悬液法、悬液法 将细菌细胞悬浮在一定的溶液中，包括蒸馏水、蔗糖、将细菌细胞悬浮在一定的溶液中，包括蒸馏水、蔗糖、将细菌细胞悬浮在一定的溶液中，包括蒸馏水、蔗糖、将细菌细胞悬浮

4、在一定的溶液中，包括蒸馏水、蔗糖、葡萄糖等糖液、磷酸缓冲液、食盐水等，有的还是用稀琼葡萄糖等糖液、磷酸缓冲液、食盐水等，有的还是用稀琼葡萄糖等糖液、磷酸缓冲液、食盐水等，有的还是用稀琼葡萄糖等糖液、磷酸缓冲液、食盐水等，有的还是用稀琼脂脂脂脂 。悬液法操作简便，效果较好，有的酵母菌、细菌可以。悬液法操作简便，效果较好，有的酵母菌、细菌可以。悬液法操作简便，效果较好，有的酵母菌、细菌可以。悬液法操作简便，效果较好，有的酵母菌、细菌可以保存几年甚至近十年。保存几年甚至近十年。保存几年甚至近十年。保存几年甚至近十年。3 3、载体法、载体法、载体法、载体法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅

5、胶、是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。保藏法应用相当广泛。保藏法应用相当广泛。保藏法应用相当广泛。4 4、真空干燥法、真空干燥法、真空干燥法、真空干燥法 这类方法包括冷冻真空干燥法和这类方法包括冷冻真空干燥法和这类方法包括冷冻真空干燥法和这类方法包括冷冻真空干燥法和L-

6、L-干燥法。前者是将干燥法。前者是将干燥法。前者是将干燥法。前者是将要保藏的微生物样品预先经过低温预冻，然后在低温状态要保藏的微生物样品预先经过低温预冻，然后在低温状态要保藏的微生物样品预先经过低温预冻，然后在低温状态要保藏的微生物样品预先经过低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥，后则则不需要低温预冻样品，只是使样下进行减压干燥，后则则不需要低温预冻样品，只是使样下进行减压干燥，后则则不需要低温预冻样品，只是使样下进行减压干燥，后则则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在品维持在品维持在品维持在10201020范围内进行真空干燥。范围内进行真空干燥。范围内进行真空干燥。范围内进行真空干燥。5

7、5、冷冻法、冷冻法、冷冻法、冷冻法1.1.菌种菌种菌种菌种 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、细黄链霉菌枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、细黄链霉菌枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、细黄链霉菌枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、细黄链霉菌2 2、培养基、培养基、培养基、培养基牛肉膏蛋白胨培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、20%20%蔗糖悬液、麸皮培养基、蔗糖悬液、麸皮培养基、蔗糖悬液、麸皮培养基、蔗糖悬液、麸皮培养基、沙土管等沙土管等沙土管等沙土管等3 3、仪器或其他用具、仪器或其他用具、仪器或其他用具、仪器或其他用具三、器材三、器材1、菌种活化、菌种活化 四、操作步骤

8、四、操作步骤2 2、传代培养法（细菌）传代培养法（细菌）传代培养法（细菌）传代培养法（细菌）：牛肉膏斜面：牛肉膏斜面：牛肉膏斜面：牛肉膏斜面 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面，1 1支支支支/人人人人，4-5ml/4-5ml/支。支。支。支。3 3、沙土管法（放线菌）：、沙土管法（放线菌）：、沙土管法（放线菌）：、沙土管法（放线菌）：取河沙加入取河沙加入取河沙加入取河沙加入10%10%浓度的盐酸漂洗，加热煮沸浓度的盐酸漂洗，加热煮沸浓度的盐酸漂洗，加热煮沸浓度的盐酸漂洗，加热煮沸3030分钟，分钟，分钟，分钟，除去有

9、机质。自来水冲洗至中性，烘干后用除去有机质。自来水冲洗至中性，烘干后用除去有机质。自来水冲洗至中性，烘干后用除去有机质。自来水冲洗至中性，烘干后用4040目筛子目筛子目筛子目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。过筛，弃去粗颗粒，备用。过筛，弃去粗颗粒，备用。过筛，弃去粗颗粒，备用。准备：准备：准备：准备：1 1支支支支/人人人人。4 4、蔗糖悬液法（酵母菌）：、蔗糖悬液法（酵母菌）：50ml50ml蒸蒸馏馏水水+10g+10g蔗蔗糖糖，溶溶解解，分分装装至至1515015150试管中，试管中，2ml/2ml/管。管。1 1支支/人。人。5 5、载体法（霉菌）：、载体法（霉菌）：麦麸培养基麦麸培养基 取

10、取20g20g麦麦麸麸 +20ml20ml水水，拌拌匀匀，制制成成含含水水量量为为50%50%的麦麸培养基。的麦麸培养基。1 1支支/人。人。保存处理保存处理保存处理保存处理斜面冰箱保存法：斜面冰箱保存法：斜面冰箱保存法：斜面冰箱保存法：斜斜斜斜面面面面，3737培培培培养养养养2424小小小小时时时时，转转转转入入入入4 4冰冰冰冰箱箱箱箱冷冷冷冷藏保存。保存期藏保存。保存期藏保存。保存期藏保存。保存期3636个月。个月。个月。个月。沙土管：沙土管：沙土管：沙土管：每每每每支支支支砂砂砂砂管管管管加加加加入入入入0.2ml0.2ml菌菌菌菌悬悬悬悬液液液液，用用用用接接接接种种种种环环环环搅

11、搅搅搅拌拌拌拌均均均均匀匀匀匀。把把把把砂砂砂砂管管管管放放放放入入入入干干干干燥燥燥燥器器器器内内内内干干干干燥燥燥燥2424小小小小时时时时后后后后，封口，在封口，在封口，在封口，在4 4冰箱或者室温干燥处保存。冰箱或者室温干燥处保存。冰箱或者室温干燥处保存。冰箱或者室温干燥处保存。每隔每隔每隔每隔3 3个月测定一次活性。保存期个月测定一次活性。保存期个月测定一次活性。保存期个月测定一次活性。保存期1515年。年。年。年。蔗糖悬液保存：蔗糖悬液保存：蔗糖悬液保存：蔗糖悬液保存：每每每每支支支支蔗蔗蔗蔗糖糖糖糖管管管管加加加加入入入入0.2ml0.2ml菌菌菌菌悬悬悬悬液液液液，混混混混合合

12、合合均均均均匀匀匀匀。把把把把蔗糖管封口，在蔗糖管封口，在蔗糖管封口，在蔗糖管封口，在4 4冰箱暗处保存。冰箱暗处保存。冰箱暗处保存。冰箱暗处保存。每隔一年测定一次活性。保存期每隔一年测定一次活性。保存期每隔一年测定一次活性。保存期每隔一年测定一次活性。保存期510510年。年。年。年。麦麸保存法麦麸保存法麦麸保存法麦麸保存法 每每每每支支支支麦麦麦麦麸麸麸麸管管管管加加加加入入入入0.2ml0.2ml菌菌菌菌悬悬悬悬液液液液，混混混混合合合合均均均均匀匀匀匀，尽尽尽尽量量量量捣捣捣捣匀匀匀匀小小小小试试试试管管管管中中中中的的的的麦麦麦麦麸麸麸麸，呈呈呈呈疏疏疏疏松松松松状状状状态态态态。3030培培培培养养养养7272小小小小时时时时，待待待待菌菌菌菌丝丝丝丝长长长长好好好好后后后后，放放放放置置置置在在在在干干干干燥燥燥燥器器器器内内内内干干干干燥燥燥燥，在在在在4 4冰箱或室温保存。冰箱或室温保存。冰箱或室温保存。冰箱或室温保存。每隔一年测定一次活性。保存期每隔一年测定一次活性。保存期每隔一年测定一次活性。保存期每隔一年测定一次活性。保存期1515年。年。年。年。1、思考题、思考题（1）根据你自己的试验，谈谈）根据你自己的试验，谈谈12种微生物种微生物菌种保藏方法的利弊？菌种保藏方法的利弊？五、实验报告五、实验报告