质粒提取定量与酶切鉴定.pptx

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1、实验流程图一、碱裂解法提取质粒三、质粒酶切三、质粒酶切二、质粒定量二、质粒定量四、酶切产物的琼脂糖电泳检测四、酶切产物的琼脂糖电泳检测最后做最后做第1页/共38页 掌握碱裂解法提取质粒的方法掌握碱裂解法提取质粒的方法 掌握紫外吸收测定掌握紫外吸收测定DNADNA的方法的方法 了解质粒酶切鉴定原理了解质粒酶切鉴定原理 掌握琼脂糖凝胶电泳技术掌握琼脂糖凝胶电泳技术实验目的实验目的第2页/共38页实验材料大肠杆菌DH5a菌株pMD18-T载体易瑞质粒小量提取试剂盒Takara EcoRI 限制性内切酶限制性内切酶Takara Hind III 限制性内切酶限制性内切酶Takara 10 M 酶切缓冲

2、液酶切缓冲液BioWest电泳琼脂糖干粉电泳琼脂糖干粉0.5TBE核酸电泳缓冲液核酸电泳缓冲液EB 核酸荧光染料核酸荧光染料Takara 6 电泳上样缓冲液电泳上样缓冲液第3页/共38页第4页/共38页实验仪器微量移液器离心机恒温水浴箱紫外检测仪电泳仪水平电泳槽第5页/共38页独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子基因工程常采用的载体一、碱裂解法提取质粒一、碱裂解法提取质粒DNA第6页/共38页碱裂解法碱裂解法；煮沸裂解；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法；羟基磷灰石柱层析法；质粒质粒DNA释放法；释放法；酸酚法等酸酚法等质粒提取方法：质粒提取方法：第7页/共38页碱裂解法基本原理

3、 基于染色体基于染色体DNA与质粒与质粒DNA的变性与复性的的变性与复性的 差异而达到分离目的。差异而达到分离目的。染色体染色体DNA：氢键断裂，：氢键断裂，变变性性。质粒质粒DNA：大部分氢键断裂，：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。条互补链不会完全分离。（不完全变性）（不完全变性）质粒质粒DNA：复性复性，溶于溶液中，溶于溶液中染色体染色体DNA：不能复性不能复性；形成缠连；形成缠连的网状结构。的网状结构。pH=12.6（碱性）（碱性）NaAc溶液溶液（pH4.8）pH=中性中性染色体染色体DNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNA、蛋

4、白质、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下复合物等一起沉淀下来来离心离心第8页/共38页u溶液S1（细菌悬浮液）u裂解液S2u中和液S3u洗涤液Wu洗脱液uRNaseA(100mg/ml)uDNA吸附柱试剂盒的组成：试剂盒的组成：溶液溶液S1：50 mmol/L葡萄糖葡萄糖10 mmol/LEDTA25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)2毫克毫克/毫升溶菌酶毫升溶菌酶裂解液裂解液S2：200 mmol/L NaOH 1%SDS中和液中和液S3：3 mol/L NaAc(pH4.8)溶液溶液第10页/共38页实验流程1.5mL 菌液菌液12000rpm1 min菌体沉淀菌体沉淀溶液溶液

5、S1250l剧烈震荡剧烈震荡裂解液裂解液S2250l颠倒混匀颠倒混匀4-6次次中和液中和液S3350l温和地温和地颠倒混匀颠倒混匀6-8次次12，000rpm10 min室温静置室温静置35min至出现白色至出现白色絮状沉淀絮状沉淀取取600l上清至上清至吸附柱管吸附柱管12，000rpm30s12，000rpm30s洗涤液洗涤液W600l12，000rpm30s12，000rpm2 min取吸附柱至取吸附柱至另一新另一新EP管管洗脱液洗脱液50l12，000rpm1 min室温静置室温静置1min弃滤液弃滤液空柱空柱收集洗脱液备用收集洗脱液备用洗涤液洗涤液W600l弃滤液弃滤液弃滤液弃滤液2

6、.2.悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞1.1.收集细胞收集细胞收集细胞收集细胞3.3.裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞4.4.中和中和中和中和6.6.洗柱洗柱洗柱洗柱7.7.洗脱洗脱洗脱洗脱5.5.过柱分离过柱分离过柱分离过柱分离第12页/共38页二、质粒DNA定量测定利用核酸在利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性处有紫外吸收的特性基本原理基本原理紫外分光光度计紫外分光光度计第14页/共38页操作步骤操作步骤1.取取5 l提取的质粒提取的质粒DNA，加入，加入95 l蒸馏水蒸馏水2.混合均匀混合均匀3.用紫外分光光度计测定用紫外分光光度计测定A260第15页/共38页DNA或或RNA的定量的

7、定量A260=1.0相当于相当于 50g/ml双链双链DNA 40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸紫外光吸收法紫外光吸收法：第16页/共38页DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0DNA或或RNA的纯度判定的纯度判定第17页/共38页三、质粒DNA的酶切分析质粒质粒 DNA:3 kb 载体载体:pMD18-T 2.7kb 基因基因:CHD5 1.4 kb第18页/共38页限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II型限制酶

8、，其识别位点长度为46个核苷酸的反向重复序列。限制性内切酶GGATCCCCTAGG第19页/共38页EcoR和Hind的识别序列和切口是：EcoR：GAATTCHind：AAGCTT第20页/共38页pMD18-T第21页/共38页反应物反应物 体积（体积（l)10 M 酶切缓冲液酶切缓冲液 2质粒质粒DNA 10Hind III 1EcoR I 1H2O 6在一个洁净的在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：离心管中混匀下列反应物：混合后混合后37 水浴水浴12h质粒质粒DNA的酶切分析操作的酶切分析操作1234第22页/共38页影响酶切反应的因素影响酶切反应的因素底物底物DNA的纯

9、度的纯度反应系统：反应系统：(反应缓冲液反应缓冲液)反应体积：反应体积：甘油浓度甘油浓度5%保温时间与温度保温时间与温度第23页/共38页四、琼脂糖凝胶电泳四、琼脂糖凝胶电泳第24页/共38页电泳：电泳：带电粒子在电场中泳动的现象带电粒子在电场中泳动的现象影响迁移率的因素？影响迁移率的因素？电场电场样品：样品：大小（分子量）大小（分子量）形状（构型）形状（构型）电荷电荷共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNA线性线性DNA开环的双链环状开环的双链环状DNA质粒质粒DNA三种构型：三种构型：共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋线性线性开环的双链环状开环的双链环状第25页/共38页胶浓度（）胶浓度（）线性线性D

10、NA分子大小分子大小（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13本次电泳使用本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶浓度与琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围分子的有效分离范围第27页/共38页琼脂糖凝胶的制备上样：加样前，样品先与6上样缓冲液混匀电泳：电压100v；30min结果观察：凝胶成像仪琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶电泳操作第28页/共38页琼脂糖凝胶电泳上样1：DNAMarker（5l）2：提取的质粒DNA（5l）3：质粒DNA酶切产物（10l）+-1234每组上每组上2个样品个样品第32页/共38页DNA M

11、arker (ladder)第33页/共38页Loading Buffer上样缓冲液EDTA甘油增大溶液密度溴酚蓝指示剂二甲苯胺蓝指示剂组成组成0.5TBE,0.5-1.4%浓度的胶中，浓度的胶中，迁移率迁移率 溴酚蓝溴酚蓝=300bp 二甲苯胺蓝二甲苯胺蓝=4kbp 第34页/共38页染色染色溴化乙锭溴化乙锭(EthidiumBromide，EB):3,8-二二氨基氨基-5-乙基乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入苯基菲啶溴盐，能插入DNA分子碱基对之间并与之结合分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射在紫外光照射下呈现红橙荧光下呈现红橙荧光,优点：优点：染色操作简便，快速染色操作简便，快速；灵敏度高灵敏度高缺点：缺点：有致癌性有致癌性(使用时一定要戴手套使用时一定要戴手套)第35页/共38页第36页/共38页1 2M3 45 6 75000300020001000bpM:DNA Marker DL50001.PCR 产物产物;2.PCR 产物产物3.质粒质粒DNA;4.质粒质粒 DNA5.酶切产物酶切产物;6.酶切产物酶切产物结果分析结果分析第37页/共38页感谢您的观看！第38页/共38页