重组DNA导入受体细胞.pptx

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1、一、转化方法 自然界中，转化并不是细菌遗传信息传递的主要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的转化。正常条件下，大部分细菌包括大肠杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高转化效率，建立了一系列的转化方法：第1页/共27页供体菌游离DNADNA供体菌DNADNA（转化因子）转化示意图转化示意图第2页/共27页 a.热激法转化感受态细胞 b.PEG介导的原生质体转化 c.高压电穿孔法转化 d.显微注射法转化 e.接合转化f.噬菌体转染 第3页/共27页大肠杆菌常用转化方法的比较 转转 化化 方方 法法转转 化化 效效 率率Ca 诱诱 导导107-8原生质体转化原生质体转化105-6噬菌体转化噬菌体

2、转化107-8电电 穿穿 孔孔 法法106-9（100Kb）接接 合合 转转 化化104-5第4页/共27页一）受体细胞应具备的条件 a.限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-（外切、内切酶）b.重组整合缺陷型RecA-（对于用于基因扩增或基因高效表达的受体）c.具有较高的转化效率 d.具有与重组体互补的遗传性状 e.感染与寄生缺陷型 安全角度的要求。第5页/共27页二）大肠杆菌感受态的制备与转化 感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cells)。第

3、6页/共27页1、热激法转化感受态细胞第7页/共27页2、氯化钙法转化第8页/共27页 在某些情况下，CaCl2只影响DNA的结合，并不影响细胞的吸收，当DNA分子加到处理的细胞内，仍然吸附在细胞的外部，并没有转化到细胞质中，将DNA带入感受态细胞的条件可提高温度到42。第9页/共27页3、PEG介导的原生质体转化第10页/共27页4、高压电穿孔法（1）基本原理在高压电场的作用下，细胞膜发生临时性破裂形成微孔，细胞外环境中的核酸分子便会穿孔而入，并最终进到细胞核内部。第11页/共27页(2)影响因素脉冲的最大电压 脉冲持续的时间 与DNA浓度则无多大关系电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。

4、对于不适合用传统方法转染的细胞，用电穿孔法得到的永久转化的频率约为10-410-5之间。第12页/共27页5、显微注射法转化在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术、人工受精、细胞核移植、基因注入、细胞内微量注射、胚胎切割等的技术。第13页/共27页第14页/共27页（1）真正的显微注射(true microinjection)法 DNA是由注射针直接注入细胞（2）“穿刺”(pricking)导入法 DNA是处在细胞周围培养基中，它通过穿刺形成的小孔进入细胞的内部，或是随穿刺的针头一道进入的。用显微注射法转移基因的效率明显地超出其它方法。显微注射用的受体细胞，多数是沿培养皿贴壁生长的单层细

5、胞。显微注射分为 第15页/共27页6、接合转化不需要细菌细胞的直接接触基因重组的范围更小，只限于更小的一段染色体片段和少数几个紧密连锁的基因 第16页/共27页细菌的细菌的“接合接合”状态状态第17页/共27页接合接合-F-F+FFF+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient第18页/共27页染色体染色体质粒F+菌F-菌F质粒的半保留转移质粒的半保留转移F+菌第19页/共27页染色体Hfr质粒F+菌F质粒转移的不同结果质粒转移的不同结果F 质粒第20页/共27页二、phage DNA的转化 两种方法可以将噬菌体DNA转入细菌：1）转染（transfection）：是将纯化的噬

6、菌体DNA通过热激的方法转化感受态大肠杆菌的过程。2）体外装配（in vitro packaging）：DNA的转染效率不高，如果将重组的分子装配成头-尾结构的病毒粒子，将极大的提高效率。第21页/共27页噬菌体转化大肠杆菌的方法 第22页/共27页一）DNA的转染 DNA的转染作用，是一种低效的过程。使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的 DNA，其典型的转染效率（即每微克DNA转染产生的噬菌斑数目），也仅为 105106之间。体外连接的结果，转染效率便下降到了104103左右。第23页/共27页二）噬菌体的体外装配 有两种不同的系统可以应用：一种是cos位点突变的噬菌体的单品系系统。另一种系统需要两种不同的缺陷品系，一个是基因D的突变体，另一个品系是基因E的突变体。第24页/共27页噬菌体体外装配的两种系统 第25页/共27页第26页/共27页感谢您的观看！第27页/共27页