11DNA重组技术的基本工具(教育精.ppt

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1、生长快、肉质好的转基因生长快、肉质好的转基因鱼鱼(中国中国)乳汁中含有人生长激素的乳汁中含有人生长激素的转基因牛转基因牛(阿根廷阿根廷)转基因实例转基因实例 一、基因工程的概念：一、基因工程的概念：又叫做又叫做基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重组技术重组技术。通。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，放到另一种生物的细胞里，定向定向地改造生物地改造生物的的遗传性状遗传性状。原理原理操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果

2、结果基因重组基因重组生物体外生物体外基因基因/DNA分子水平分子水平剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达人类需要的基因产物人类需要的基因产物回顾：回顾：优点：优点：定向定向地改造生物的地改造生物的遗传性状遗传性状；实现基因在不同物种之间的转移，迅速培育实现基因在不同物种之间的转移，迅速培育出生物新品种出生物新品种1 1基因拼接的理论基础基因拼接的理论基础(1)大多数生物的遗传物质是大多数生物的遗传物质是DNA。(2)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(3)双链双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。构。一、基因工程诞生的

3、理论基础一、基因工程诞生的理论基础2 2外源基因在受体内表达的理论基础外源基因在受体内表达的理论基础(1)(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)(3)生物界共用一套遗传密码。生物界共用一套遗传密码。1.1 DNA1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具工欲善其事,必先利其器.想一想想一想:获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢?实现这一精确的操作过程的工具是什么呢实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?准确切割准确切割DNA的工具（的工具（“分子手

4、术刀分子手术刀”）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA片段的连接工具（片段的连接工具（“分子缝合针分子缝合针”）DNA连接酶连接酶基因转移工具（基因转移工具（“分子运输车分子运输车”）基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体二、二、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具原核生物为什么没有在长期的进化过程中由于外源原核生物为什么没有在长期的进化过程中由于外源DNA的入侵而灭绝，有什么保护机制？的入侵而灭绝，有什么保护机制？限制性内切酶从哪里寻找？限制性内切酶从哪里寻找？（一）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶防止外来病原物的侵害。当外源防止外来病原物的侵害。当外源DNA侵入时，侵

5、入时，会利用限制酶会利用限制酶将外源将外源DNA切割切割掉，以保证自掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到起到切割外源切割外源DNA、使之失效、使之失效，从而达到，从而达到保保护自身护自身的目的。的目的。限制性核酸内切酶的作用特点：限制性核酸内切酶的作用特点：1.能识别特定核苷酸序列；能识别特定核苷酸序列；2.从特定部位的两个核苷酸之间切开。从特定部位的两个核苷酸之间切开。限制性内切酶限制限制酶酶黏性末端和平末端限制酶所识别的序列有什么特点 限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还个碱基还是是4个碱基，都可以找到一条中

6、心轴线，个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链中轴线两侧的双链DNA上的碱基是上的碱基是反向反向对称重复排列对称重复排列的。的。限制酶的识别序列：限制酶的识别序列：能被限制性内切酶特能被限制性内切酶特异性识别的切割部位异性识别的切割部位都具有回文序列：在都具有回文序列：在切割部位，一条链正切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序一条链反向读的顺序完全一致。完全一致。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”(1)(1)来源来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)(2)化学本质：蛋白质。化学本质：蛋白

7、质。(3)(3)作用作用 (4)(4)作用特点：特异性作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱即限制酶可识别特定的脱 氧核苷酸序列氧核苷酸序列,切割特定位点。切割特定位点。(5)(5)切割方式切割方式催化作用催化作用,所以可重复利用所以可重复利用可用于可用于DNADNA的切割获取目的基因和载体的切割的切割获取目的基因和载体的切割错位切：产生两个相同的黏性末端错位切：产生两个相同的黏性末端平切：形成平末端平切：形成平末端限制酶DNA解旋酶区别限制性内切酶与限制性内切酶与DNA解旋酶的区别解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键的磷酸二酯键将将DNADNA两条链的氢键两条链

8、的氢键打开形成两条单链打开形成两条单链1、种类：、种类：2、作用：、作用：两类两类Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶 将双链将双链将双链将双链 DNADNA片段片段片段片段“缝合缝合缝合缝合”起来，起来，起来，起来，恢复被恢复被恢复被恢复被限制酶切开限制酶切开限制酶切开限制酶切开的两个核苷的两个核苷的两个核苷的两个核苷酸酸之间的之间的之间的之间的磷酸二酯键磷酸二酯键,这样一个重组的这样一个重组的这样一个重组的这样一个重组的DNADNA分子就形成了。分子就形成了。分子就形成了。分子就形成了。（二）、（二）、分子缝合针分子缝合针DNADNA连接酶连接酶3、EcoliEcoliD

9、NADNA连接酶连接酶连接酶连接酶与与T4DNAT4DNA连接酶比较连接酶比较连接酶比较连接酶比较：类型类型来源来源来源来源EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别 可

10、把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，EcoliEcoli DNA DNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶即即即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶以下是两种限制酶切割后形成的以下是两种限制酶切割后形成

11、的DNA片段，试分析：片段，试分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中其中和和 是由一种限制酶切割形成的是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个末端，两者要重组成一个DNA 分子，分子，所用所用DNA连接酶通常是连接酶通常是 。（2）和和 是由另一种限制酶切割形是由另一种限制酶切割形成的成的 末端，两者要形成重组末端，两者要形成重组DNA片段，片段，所用的连接酶通常是所用的连接酶通常是 。反馈练习：反馈练习：T4DNA连接酶连接酶E.coliDNA连接酶连接酶平平黏性黏性DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同点相

12、同点DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，将将将将单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上的双链上的两两个缺口同时连接个缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需

13、要模板据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（）A.限制性内切酶可以切断限制性内切酶可以切断a处，处，DNA连接酶可以连接连接酶可以连接a处处B.DNA聚合酶可以连接聚合酶可以连接a处处C.解旋酶可以使解旋酶可以使b处解开处解开D.连接连接C处的酶可以为处的酶可以为DNA连接酶连接酶D常用的载体：质粒常用的载体：质粒复制起始的复制起始的复制起始的复制起始的一段序列一段序列一段序列一段序列有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的有标记基因的有标记基因的存在，可用含存在，可用含存在，可用含存在，可用含氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨

14、苄青霉素的氨苄青霉素的培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体-“分子运输车分子运输车”质粒存在于许多细菌质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物细以及酵母菌等生物细胞中。是一种裸露的、胞中。是一种裸露的、结构简单、独立于细结构简单、独立于细菌拟核菌拟核DNA或细胞核或细胞核之外自我复制的很小之外自我复制的很小的双链环状的双链环状DNA分子分子运载体需具备的四个条件：运载体需具备的四个条件：有一至多个不同的限制酶切点有一至多个不同的限制酶切点对受体细胞无害对受体细胞无害导入基因导入基因能在受体细胞中复制、表达能在受体细胞中复制、表达（能在宿主细胞内复制并稳定地保存）能在宿主细胞内复制并稳定地保存）具具有某些标记基因，便于筛选有某些标记基因，便于筛选常用运载体：常用运载体：细菌的质粒细菌的质粒 噬菌体衍生物噬菌体衍生物 (3)(3)动植物病毒动植物病毒注意：注意：在基因工程操作中，运载体都是天然的质粒或在基因工程操作中，运载体都是天然的质粒或病毒经过人工改造的病毒经过人工改造的不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制能复制 （）B、有、有多个限制酶切点多个限制酶切点 C、具有标记基因具有标记基因 D、它是环状它是环状DNAD