基因工程和24章人类基因组计划.ppt

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1、n基因工程的相关技术基因工程的相关技术n基因工程主要的工具酶基因工程主要的工具酶n基因克隆的主要载体基因克隆的主要载体n重组重组DNA的基本步骤的基本步骤n基因工程的应用和成果简介基因工程的应用和成果简介 第第2323章章 重组重组DNADNA技术技术 基因工程的概念基因工程的概念 genetic engineering定义：定义：又称为重组又称为重组DNA技术，指将某些特技术，指将某些特定的基因或定的基因或DNA片断，通过载体或其它片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。中增殖并表达的一种遗传学操作。目的目的:是生

2、产出符合人类需要的产品或创是生产出符合人类需要的产品或创造出稳定遗传的生物新性状。造出稳定遗传的生物新性状。重要特征重要特征1、可把来自任何生物的基因转移到与其毫无、可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状生物的遗传特性，创造出生物的新性状2、某一段、某一段DNA可在受体细胞内进行复制，可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的为制备大量纯化的DNA片段提供了可能片段提供了可能核酸的分子杂交核酸的分子杂交的变性和复性的变性和复性 基因工程的相关技术基因工程的相关技术杂交分子分子探针寻找特定基

3、因.聚合酶链式反应（）是一种体外扩增技术其基本原理类似于的天然复制过程其以拟扩增的为模板，以一对分别于和末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在聚合酶作用下，按半保留复制机制沿模板链延伸直至完成新的合成，反复重复这一过程就使目的基因得到扩增组成反应体系的基本成分模板特异性引物聚合酶（耐热）ds含有g的缓冲液PCR反应过程反应过程 第一步：高温变性（解链）第一步：高温变性（解链）95 第二步：低温退火第二步：低温退火 55 第三步：适温延伸第三步：适温延伸 72 变性变性：双链DNA解链成为单链DNA退火退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸延伸：以目的基因为模板，合成互补的新

4、DNA链PCR反应过程反应过程聚合酶链式反应（PCR）l每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得230（1.07109)个基因片段23.2 基因工程主要的工具酶 限制性内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 反转录酶1、限制性内切酶限制性内切酶DNA操作的分子手术刀限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别一小段特殊的核酸序列并将其在特定位点处切开。u Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性的工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。DNA连接酶及其连接作用 大肠杆菌DNA连接酶(黏性末端)噬菌体T4DNA连接酶(黏性末端和平齐末端)反转录

5、酶 兼有RNA外切酶的活性23.3 基因克隆的质粒载体 载体是运送目的基因片段进入宿主载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒。菌质粒。质粒是细菌细胞中自然存在于染色质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状体外可以自主复制的一段环状DNA分子。分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。增加其拷贝数。23.423.4 基因工程技术路线基因工程技术路线（1）获得目的基因和载体（2）切割、连接形成新的重组DNA分子（3）重组DNA分子导入受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传（

6、4）对转化子筛选和鉴定（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物基因工程的操作流程获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(genelibrary)，从中调用目的基因(2)人工合成（3）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段（4）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等 DNA分子的体外重组黏性末端连接法 同一限制性内切酶作用 DNA连接酶作用平齐末端连接法(人工接头加尾)23.4.3 转化受体细胞和转化子的筛选转化受体细胞和转化子的筛选细菌：细菌：类似于前面所讲，由质粒携带目的类似于前

7、面所讲，由质粒携带目的基因，转入相应的细菌细胞内并进行表达。基因，转入相应的细菌细胞内并进行表达。图图23.7 23.7 和和 23.8 23.8基因工程的应用基因工程的应用1.1.利用转基因的细菌、植物或动物生利用转基因的细菌、植物或动物生产某些蛋白质药物产某些蛋白质药物 1982 1982年，美国食品与药物管理局批准年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品了首例基因工程产品人胰岛素人胰岛素投放市投放市场，利用重组场，利用重组DNADNA技术生产胰岛素是生技术生产胰岛素是生物技术领域发展的一个里程碎。它标志了物技术领域发展的一个里程碎。它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。此基因工

8、程产品正式进入到商业化阶段。此后，又出现了更多的基因工程产品和蛋白后，又出现了更多的基因工程产品和蛋白质药物，如质药物，如人生长激素、干扰素、白细胞人生长激素、干扰素、白细胞介素介素-2-2、粒细胞集落因子、乙肝疫苗、粒细胞集落因子、乙肝疫苗等等。等等。我国生产的部分基因我国生产的部分基因工程疫苗和药物工程疫苗和药物2.2.基因工程技术在农业、畜牧业上的基因工程技术在农业、畜牧业上的应用最为广泛应用最为广泛生长快、肉质好的转基生长快、肉质好的转基因鱼因鱼(中国中国)乳汁中含有人生长激素乳汁中含有人生长激素的转基因牛的转基因牛(阿根廷阿根廷)转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗

9、寒基转鱼抗寒基因的番茄因的番茄3 3、基因工程与环境保护、基因工程与环境保护环境监测：环境监测：基因工程做成的基因工程做成的DNADNA探针能够十分灵敏地探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。检测环境中的病毒、细菌等污染。1t1t水中只有水中只有1010个病毒也能被个病毒也能被DNADNA探针检测出来探针检测出来利用基因工程培育的利用基因工程培育的“指示生物指示生物”能十分能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。环境污染治理：环境污染治理：基因工程做成的基因

10、工程做成的“超级细菌超级细菌”能吞食和分能吞食和分解多种污染环境的物质。解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的工程培育成功的“超级细菌超级细菌”却能分解石油中的多种烃却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDTDDT等毒害物质。等毒害物质。第第24章章 人类基因组人类基因组24.1 24.1 人类基因组及其组成人类基因组及其组成基因组基因组:一个单倍体细胞核中、一个细胞器中、一个单倍体细胞核中、一个细胞器中、或一个病毒毒粒中所含的全部

11、或一个病毒毒粒中所含的全部DNADNA（或（或RNARNA）分）分子的总称。子的总称。基因组学：研究生物体的基因和基因组的结构组基因组学：研究生物体的基因和基因组的结构组成、不稳定性、和功能的科学。分为结构基因成、不稳定性、和功能的科学。分为结构基因组学和功能基因组学。组学和功能基因组学。结构基因组学结构基因组学 研究基因和基因组的结构，各种遗传研究基因和基因组的结构，各种遗传元件的组成物质的序列特征，基因定位和基因组元件的组成物质的序列特征，基因定位和基因组的作图等。的作图等。功能基因组学功能基因组学 在基因组水平上阐明在基因组水平上阐明DNADNA序列的功能，序列的功能，着重研究不同的序列

12、结构所具有的不同功能，基着重研究不同的序列结构所具有的不同功能，基因的表达与调控，基因和环境之间的相互作用。因的表达与调控，基因和环境之间的相互作用。人类基因组的人类基因组的DNA序列组成序列组成人类基因组有人类基因组有3.2103.2109 9个个bpbp的的DNADNA，有约，有约4 4万个基因。万个基因。基因及相关序列约占基因及相关序列约占10%10%，基因外序列约，基因外序列约占占90%90%。见图见图24.124.124.1.2 人类基因组各组成成分的基本特征1 基因：断裂基因，存在大小差异和内含子数量的差异。与基因相关的序列：存在于3非编码区的3UTR和5端UTR，只转录而不被翻译

13、 启动子序列存在于转录起始位点的上游。2 2 基因外基因外DNADNA：70-80%70-80%为单一和低拷贝形式存在；为单一和低拷贝形式存在；20-30%20-30%为中度或高度为中度或高度重复序列重复序列。在基因组中重复出现的在基因组中重复出现的DNA序列序列。分散重复序列分散重复序列(这些序列以散在的形式分布在基因这些序列以散在的形式分布在基因组中组中)长分散重复序列长分散重复序列 LINE（1000bp，一万份，一万份）短分散重复序列短分散重复序列 SINE（100-300bp，10万份万份）串联重复序列串联重复序列 1 1 卫星卫星DNADNA（重复单元（重复单元100-5000kb

14、100-5000kb）2 2 小卫星小卫星DNADNA（9-70bp9-70bp）3 3 微卫星微卫星DNA(1-4bp)DNA(1-4bp)24.2癌基因与恶性肿瘤癌基因与恶性肿瘤肿瘤的基本特征：肿瘤的基本特征：正常的细胞的增殖和凋亡失控，扩张性增生正常的细胞的增殖和凋亡失控，扩张性增生的细胞群形成肿块的细胞群形成肿块分类：分类：良性肿瘤良性肿瘤恶性肿瘤：（癌）能侵染周围组织和器官，恶性肿瘤：（癌）能侵染周围组织和器官，有远端转移能力，破坏被侵染的脏器，直至机有远端转移能力，破坏被侵染的脏器，直至机体死亡体死亡正常细胞与癌细胞比较正常细胞与癌细胞比较癌基因和抗癌基因癌基因和抗癌基因病毒癌基因

15、病毒癌基因(Virus oncogene V-onc).(Virus oncogene V-onc).19761976年年H.EvarmusH.Evarmus和和发发现现鸟鸟类类肉肉瘤瘤病病毒毒中含有致癌基因。被命名为中含有致癌基因。被命名为病毒癌基因病毒癌基因细胞癌基因或原癌基因细胞癌基因或原癌基因：在在正正常常人人或或动动物物细细胞胞内内有有与与V-oncV-onc同同源源的基因称的基因称细胞癌基因或原癌基因细胞癌基因或原癌基因癌癌 基基 因因癌癌基基因因是是正正常常细细胞胞中中的的一一些些基基因因，是是细细胞胞生生长长发发育育所所必必需需的的。一一旦旦这这些些基基因因在在表表达达时时间间

16、、表表达达部部位位、表表达达数数量量及及表表达达产产物物结结构构等等方方面面发发生生了了异异常常，就可以导致细胞无限增殖并出现恶性转化。就可以导致细胞无限增殖并出现恶性转化。癌癌癌癌基基基基因因因因(oncogene)(oncogene)：是是是是指指指指能能能能引引引引起起起起细细细细胞胞胞胞恶恶恶恶性性性性转转转转化化化化的的的的基因。基因。基因。基因。vv原癌基因原癌基因原癌基因原癌基因(proto(proto oncogeneoncogene)抗癌基因抗癌基因（antioncogene）有些基因的存在和表达使细胞不能癌变有些基因的存在和表达使细胞不能癌变和机体不长癌，这类基因被称为抗癌

17、基和机体不长癌，这类基因被称为抗癌基因因细胞癌变的过程是原癌基因被激活而抑细胞癌变的过程是原癌基因被激活而抑癌基因失活癌基因失活癌症的遗传学基础基因突变基因突变 遗传物质的损伤和基因结构的改变是细胞遗传物质的损伤和基因结构的改变是细胞发生恶性转化的必要前提。发生恶性转化的必要前提。多次遗传改变的致癌作用多次遗传改变的致癌作用（三）人类基因组作图（三）人类基因组作图人类基因组计划人类基因组计划(Human Genome Project(Human Genome Project，HGP)HGP)旨在阐明人类基因组旨在阐明人类基因组DNADNA长达长达3 X 103 X 109 9碱基碱基对的序列，

18、发现所有人类基因并阐明其对的序列，发现所有人类基因并阐明其在染色体上的位置，从而在整体上破译在染色体上的位置，从而在整体上破译人类遗传信息。人类遗传信息。美国于美国于19901990年正式启动年正式启动HGPHGP，投资，投资3030亿元，亿元，计划于计划于20052005年完成人类基因组全部序列年完成人类基因组全部序列的测定。的测定。人类基因组计划的内容人类基因组计划的内容遗传图谱遗传图谱物理图谱物理图谱转录图谱转录图谱序列图谱序列图谱遗传图谱遗传图谱（genetic map）又称又称连锁图谱（连锁图谱（linkage maplinkage map），），是是表示基因或表示基因或DNADNA

19、标志在染色体上的相对位标志在染色体上的相对位置与遗传距离的基因组图，反映染色体上置与遗传距离的基因组图，反映染色体上两点之间的连锁关系。两点之间的连锁关系。遗传图谱是以细胞减数分裂时同源染遗传图谱是以细胞减数分裂时同源染色体发生交换的色体发生交换的DNADNA区段为标记。遗传距区段为标记。遗传距离通常以基因或离通常以基因或DNADNA片段在染色体交换过片段在染色体交换过程中的重组频率程中的重组频率cMcM来表示。来表示。物理图谱物理图谱（physical map）物理图谱指物理图谱指DNADNA序列上两点之间的实际距序列上两点之间的实际距离离,其目标是在基因组中每其目标是在基因组中每100kb

20、100kb设一个标志设一个标志点（即点（即“路标路标”）;目前最满意的是以已目前最满意的是以已定位的定位的DNADNA序列序列标记位点标记位点（sequencing sequencing tagged sitetagged site，STSSTS）作为作为“路标路标”，以，以DNADNA的实际长度为的实际长度为“图距图距”绘制物理图谱。物理绘制物理图谱。物理图谱是进行图谱是进行DNADNA序列分析和基因组织结构研序列分析和基因组织结构研究的基础。究的基础。转录图谱转录图谱（transcription map）转录图谱又称转录图谱又称cDNA（complementary DNA）计划，是以表达计

21、划，是以表达序列标签序列标签（expression sequence tag，EST）为标志绘制的图谱。为标志绘制的图谱。在获得足够多的在获得足够多的ESTEST序列后，对这些序列后，对这些ESTEST片段进片段进行染色体定位，最终绘制成一张可表达的基因图行染色体定位，最终绘制成一张可表达的基因图转录图谱。有了这张转录图谱，我们就可以转录图谱。有了这张转录图谱，我们就可以了解不同基因在不同的时间、不同组织的表达情了解不同基因在不同的时间、不同组织的表达情况；以及正常与异常状况下基因表达的差异。况；以及正常与异常状况下基因表达的差异。来来自不同组织和器官的自不同组织和器官的ESTEST可为基因的

22、功能研究提供有价值可为基因的功能研究提供有价值的信息，为基因鉴定提供候选基因。的信息，为基因鉴定提供候选基因。序列图谱序列图谱 人类基因组计划最终要测定出由人类基因组计划最终要测定出由3103109 9 bpbp核苷酸组成的人基因组核苷酸组成的人基因组DNADNA的的全部序列。全部序列。随着全新测序技术与策略的参与，随着全新测序技术与策略的参与，这项工作的进度大大加快，已远远超越这项工作的进度大大加快，已远远超越了原定计划的时间表。目前已全部完成。了原定计划的时间表。目前已全部完成。（四）人类基因组计划的步伐（四）人类基因组计划的步伐 19901990年，年，HGPHGP正式启动；正式启动；1

23、9911991年，人类染色体基因组数据库（年，人类染色体基因组数据库（GDBGDB）建立；建立；19921992年，低分辨率人类基因组遗传图谱发表；年，低分辨率人类基因组遗传图谱发表；19931993年，对年，对HGPHGP的目标进行了修正；的目标进行了修正；19941994年，遗传图谱比原目标提前一年完成；年，遗传图谱比原目标提前一年完成；19951995年，最小的细菌年，最小的细菌生殖器支原体测序完成；生殖器支原体测序完成；19961996年，真核生物酵母基因组测序完成；年，真核生物酵母基因组测序完成；19971997年，大肠杆菌基因组测序完成；年，大肠杆菌基因组测序完成；19981998

24、年，秀丽线虫基因组测序完成；同年年，秀丽线虫基因组测序完成；同年5 5月，月，celeracelera公司宣布加入公司宣布加入HGPHGP，HGPHGP的进程走了一半；的进程走了一半；19991999年初，年初，celeracelera公司宣布果蝇的测序完成；公司宣布果蝇的测序完成；19991999年年9 9月，中国获准加入该计划，测月，中国获准加入该计划，测1 1的基因组，的基因组，也就是也就是3 3号染色体上的号染色体上的30Mb30Mb；19991999年年1212月，国际人类基因组计划联合研究小组宣布月，国际人类基因组计划联合研究小组宣布 对第一条人类染色体对第一条人类染色体2222号

25、染色体测序完成；号染色体测序完成；20002000年年4 4月，中国科学家按照国际人类基因组计划的部月，中国科学家按照国际人类基因组计划的部署，完成了署，完成了1%1%人类基因组的工作框架图；人类基因组的工作框架图；20002000年年5 5月，人类第月，人类第2121号染色体的测序完成；号染色体的测序完成；20002000年年6 6月月2626日，日，HGPHGP科学家、美国总统克林顿以及科学家、美国总统克林顿以及celeracelera公司负责人同时宣布人类基因组序列的公司负责人同时宣布人类基因组序列的“工作框架工作框架图图”完成。完成。20012001年年2 2月，月，ScienceSc

26、ience和和NatureNature分别发表了经过分别发表了经过整理、分类和排列的基因组整理、分类和排列的基因组“精细图精细图”及初步分及初步分析结果。同年，人类第析结果。同年，人类第2020号染色体测序完成；号染色体测序完成；20022002年年1212月，小鼠基因组序列草图发表；月，小鼠基因组序列草图发表；20032003年年1 1月，人类第月，人类第1414号染色体测序完成；号染色体测序完成；20032003年年4 4月月1414日，人类基因组计划宣布完成日，人类基因组计划宣布完成。（五）人类基因组计划的研究价值（五）人类基因组计划的研究价值医学领域：医学领域：将人类感知生命的里程提高

27、到将人类感知生命的里程提高到分子水平阶段，大大加速人们对疾病基因分子水平阶段，大大加速人们对疾病基因的鉴定；的鉴定；生命科学领域生命科学领域：阐明基因的结构与功能关：阐明基因的结构与功能关系，细胞的发育、生长、分化的分子机理，系，细胞的发育、生长、分化的分子机理，疾病发生的机理等，有利于理解生物是如疾病发生的机理等，有利于理解生物是如何进化的；何进化的；促进生命科学与信息科学相结合：促进生命科学与信息科学相结合：生物信生物信息学；息学；技术经济价值技术经济价值：医药、保健、农业和食品：医药、保健、农业和食品制造等产业。制造等产业。（六）后基因组研究（六）后基因组研究功能基因组学：功能基因组学：

28、蛋白质组学蛋白质组学：基因功能鉴定、基因表基因功能鉴定、基因表达分析及突变检测；达分析及突变检测；分析基因编码产物分析基因编码产物蛋白蛋白质的结构、功能和蛋白质群质的结构、功能和蛋白质群体内相互作用。体内相互作用。糖组学：糖组学：研究糖的合成、降解及调控，糖研究糖的合成、降解及调控，糖复合物的修饰、糖的分析测序及复合物的修饰、糖的分析测序及功能等。功能等。常染色体显性遗传病的遗传常染色体显性遗传病的遗传常染色体完全显性遗传的特征常染色体完全显性遗传的特征 由由于于致致病病基基因因位位于于常常染染色色体体上上，因因而而致致病病基基因因的遗传与性别无关，即男女患病的机会均等的遗传与性别无关，即男女

29、患病的机会均等患患者者的的双双亲亲中中必必有有一一个个为为患患者者，但但绝绝大大多多数数为为杂杂合合子子，患患者者的的同同胞胞中中约约有有1/21/2的的可可能能性性也也为为患患者；者；系系谱谱中中可可见见本本病病的的连连续续传传递递，即即通通常常连连续续几几代代都可以看到患者；都可以看到患者；双双亲亲无无病病时时，子子女女一一般般不不会会患患病病（除除非非发发生生新新的基因突变）。的基因突变）。常染色体显性遗传病的遗传常染色体显性遗传病的遗传短指症常染色体隐性遗传病的遗传常染色体隐性遗传病的遗传常染色体完全隐性遗传的特征常染色体完全隐性遗传的特征 由由于于基基因因位位于于常常染染色色体体上上

30、，所所以以它它的的发发生生与与性性别别无关，男女发病机会相等；无关，男女发病机会相等；系系谱谱中中患患者者的的分分布布往往往往是是散散发发的的，通通常常看看不不到到连连续续传传递递现现象象，有有时时在在整整个个系系谱谱中中甚甚至至只只有有先先证证者者一个患者；一个患者；患患者者的的双双亲亲表表型型往往往往正正常常，但但都都是是致致病病基基因因的的携携带带者者，此此时时出出生生患患儿儿的的可可能能性性约约占占1/41/4，患患儿儿的的正正常常同同胞胞中中有有2/32/3的的可可能能性性为为携携带带者者；近近亲亲婚婚配配时时，子子女女中中隐隐性性遗遗传传病病的的发发病病率率要要比比非非近近亲亲婚婚

31、配配者者高高得得多多。这这是是由由于于他他们们来来自自共共同同的的祖祖先先，往往往往具具有有某种共同的基因。某种共同的基因。X连锁显性遗传病连锁显性遗传病抗维生素抗维生素D D佝偻病佝偻病X连锁隐性遗传病的遗传连锁隐性遗传病的遗传X连锁隐性遗传病的遗传特点：连锁隐性遗传病的遗传特点：人群中男性患者远较女性患者多，系谱中往人群中男性患者远较女性患者多，系谱中往往只有男性患者；往只有男性患者；双亲无病时，儿子可能发病，女儿则不会发双亲无病时，儿子可能发病，女儿则不会发病；儿子如果发病，母亲肯定是一个携带者，病；儿子如果发病，母亲肯定是一个携带者，女儿也有女儿也有1/2的可能性为携带者；的可能性为携

32、带者；男性患者的兄弟、外祖父、舅父、姨表兄弟、男性患者的兄弟、外祖父、舅父、姨表兄弟、外甥、外孙等也有可能是患者；外甥、外孙等也有可能是患者；如果女性是一患者，其父亲一定也是患者，如果女性是一患者，其父亲一定也是患者，母亲一定是携带者。母亲一定是携带者。Y Y连锁遗传病的遗传连锁遗传病的遗传Y连锁遗传病的遗传特点：连锁遗传病的遗传特点：具有具有Y连锁基因者均为男性，这些基连锁基因者均为男性，这些基因将随因将随Y染色体进行传递，父转子、子传染色体进行传递，父转子、子传孙，因此称为全男性遗传。孙，因此称为全男性遗传。多基因遗传病多基因遗传病哮喘 原发性高血压 糖尿病先天畸形等特点：有家族聚集倾向 患者亲属的发病率高于一般群体