实验二显微镜油镜的使用、细胞形态的观察及革兰氏染色.ppt

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1、实验二二 显微微镜油油镜的使用、的使用、细胞形胞形态的的观察及革察及革兰氏染色氏染色 1、显微镜油镜的使用2、细菌形态的观察（示教）（示教）3、革兰氏染色一、一、实验目的目的1.1.学学习并掌握普通光学并掌握普通光学显微微镜的构造和的构造和油油镜的使用的使用技技术及及维护的基本知的基本知识；2.2.掌握掌握细菌菌革革兰氏染色氏染色的原理和方法，学的原理和方法，学会在油会在油镜下下观察察细胞和胞和识别细菌的形菌的形态特征。特征。二、二、实验原理原理1.1.光学部分光学部分:接目接目镜、接物接物镜、照明装置照明装置(聚光聚光镜、虹彩光圈、反光虹彩光圈、反光镜等等)。它使它使检视物放大物放大,造成物

2、象。造成物象。2.2.机械部分机械部分:镜座、座、镜臂、臂、镜筒、物筒、物镜转换器、器、载物台、物台、载物台物台转移器、粗移器、粗调节器、器、细调节器等部件。它起着支持、器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。、固定等作用。（一）普通光学（一）普通光学显微微镜图图1-1-2 光学显微镜的成像原理光学显微镜的成像原理倒立的虚像倒立的虚像显微微镜的放大倍数和分辨率的放大倍数和分辨率D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰2.2.显微微镜的分辨率的分辨率：是表示：是表示显微微镜辨析物体（两端）两点之辨析物体（两端）两点之间距距离的能力，可用公式表示离的能力，可用公式

3、表示为：D D（R R）=0.61/nSin/2=0.61/nSin/2n式中式中D D：物：物镜分辨出物体两点分辨出物体两点间的的最短距离最短距离。：可：可见光的波光的波长（平均（平均0.550.55 m)m)n n:物物镜和被和被检标本本间介介质的折的折射率。射率。：镜口角（即入射角）。口角（即入射角）。1.1.放大倍数放大倍数=接物接物镜放大倍数放大倍数接目接目镜放大倍数放大倍数镜口率镜口率 N.A=nSin/2 油油镜(OI,HI,100X)，即油浸，即油浸接物接物镜。当光。当光线由反光由反光镜通通过玻片与玻片与镜头之之间的空气的空气时，由，由于空气与玻片的密度不同，使于空气与玻片的密

4、度不同，使光光线受到曲折，受到曲折，发生散射，降生散射，降低了低了视野的照明度。若中野的照明度。若中间的的介介质是一是一层油（油（其折射率与玻其折射率与玻片的相近片的相近），），则几乎不几乎不发生折生折射，增加了射，增加了视野的野的进光量，从光量，从而使物象更加清晰。而使物象更加清晰。u根据公式根据公式D=0.61/nSin/2D=0.61/nSin/2，增大分母，使得增大分母，使得D值减小，分辨值减小，分辨率增大。率增大。（二）油（二）油镜使用的原理使用的原理1.1.不准擅自拆卸不准擅自拆卸显微微镜的任何部件的任何部件,以免以免损坏。坏。2.2.镜面只能用面只能用擦擦镜纸擦，不能用手指或粗布

5、，以保擦，不能用手指或粗布，以保证光光洁度度3.3.观察察标本本时，必，必须依次用依次用低、中、高倍低、中、高倍镜，最后用油最后用油镜。当。当目目视接目接目镜时，特，特别在在使用油使用油镜时，切不可使用粗，切不可使用粗调节器器，以免以免压碎玻片或碎玻片或损伤镜面。面。4.4.拿拿显微微镜时，一定要，一定要右手右手拿拿镜臂，臂，左手左手托托镜座，不可座，不可单手拿，手拿，更不可更不可倾斜拿。斜拿。5.5.油油镜使用使用结束后，物束后，物镜用擦用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油香柏油；第二遍擦；第二遍擦镜纸蘸上蘸上乙醇乙醇再擦再擦镜头；第三遍再用干；第三遍再用干净的擦的

6、擦镜纸擦去多余的擦去多余的乙醇乙醇。6.6.显微微镜应存放存放在阴凉干燥在阴凉干燥处，以免，以免镜片滋生霉菌而腐片滋生霉菌而腐蚀镜片片。（三）（三）显微微镜保养和使用中的注意事保养和使用中的注意事项1 1、实验原理（原理（p.29p.29）革革兰氏染色法：氏染色法：细菌学中重要的菌学中重要的鉴别染色法。染色法。有芽有芽孢的杆菌的杆菌和和绝大多数球菌大多数球菌以及以及所有的放所有的放线菌和真菌菌和真菌都呈革都呈革兰氏氏阳性阳性反反应；弧菌、螺旋体弧菌、螺旋体和和大多数致病性的无芽大多数致病性的无芽孢杆菌杆菌都都呈呈现阴性阴性反反应。（四）、革（四）、革兰氏染色原理氏染色原理n根据革根据革兰氏阴性

7、菌和革氏阴性菌和革兰氏阳性菌之氏阳性菌之间细胞壁胞壁的的结构差异构差异来达到染色的目的的。来达到染色的目的的。n先用先用结晶紫初染晶紫初染，所有的，所有的细菌都被染成初染料的菌都被染成初染料的蓝紫色紫色；n然后用然后用碘媒染碘媒染，它与，它与结晶紫晶紫结合成合成结晶紫晶紫碘复合碘复合物物，从而增，从而增强了染料与了染料与细菌的菌的结合力。合力。n然后再用然后再用乙醇脱色乙醇脱色处理。理。（四）、革（四）、革兰氏染色原理氏染色原理n由于革由于革兰氏氏阳性菌阳性菌细胞壁主要由胞壁主要由肽聚糖形成网状聚糖形成网状结构、壁厚、构、壁厚、类脂脂质含量低，含量低，脱色脱色时网孔收网孔收缩，结晶紫晶紫碘碘不

8、易被洗脱不易被洗脱而保留在而保留在细胞内，复染胞内，复染时仍仍保持保持蓝紫色紫色。n而革而革兰氏氏阴性菌阴性菌由于由于细胞壁的胞壁的肽聚糖聚糖层较薄、薄、类脂含量高，所以当脱色脂含量高，所以当脱色处理理时类脂被乙醇溶解，脂被乙醇溶解，细胞壁透性增大，胞壁透性增大，结晶紫晶紫碘复合物被洗脱，复染碘复合物被洗脱，复染时细胞被染上复染胞被染上复染剂的的颜色色（红色）色）。（四）、革（四）、革兰氏染色原理氏染色原理大肠杆菌大肠杆菌葡萄球菌葡萄球菌1 1、菌种、菌种：大：大肠杆菌、白色葡萄球菌杆菌、白色葡萄球菌2 2、仪器器：显微微镜3 3、染色液、染色液：草酸：草酸铵结晶紫晶紫染色液、染色液、Lugo

9、l(Lugol(路哥路哥尔氏氏)碘液碘液、9595乙醇、乙醇、0.5%0.5%沙黄沙黄染色液染色液4 4、材料、材料：载玻片、香柏油、乙醇、擦玻片、香柏油、乙醇、擦镜纸三、三、实验材料材料（一）（一）显微微镜油油镜观察操作方法察操作方法在高倍在高倍镜或低倍或低倍镜下下找到找到要要观察的察的样品区域品区域后，然后将后，然后将油油镜转到工作位置。在待到工作位置。在待观察的察的样品品区域滴区域滴加香柏油加香柏油，从，从侧面面注注视，用，用粗粗调节器器使油使油镜浸在浸在镜油中并几乎与油中并几乎与标本相接。然后用本相接。然后用细调节器器调节，在目，在目镜下找到最合适的下找到最合适的观察点。察点。四、四、

10、实验操作步操作步骤p油油镜使用使用毕后后：上升上升镜筒，筒，取下取下载玻玻片，用擦片，用擦镜纸拭去拭去镜头上的上的镜油油，然，然后用擦后用擦镜纸蘸少蘸少许乙醇乙醇擦擦去去镜头上残上残留的油迹，留的油迹，最后最后用干用干净的擦的擦镜纸擦去擦去残留的残留的乙醇。乙醇。四、四、实验操作步操作步骤n本本实验室室按小按小组使用固定使用固定编号的号的显微微镜，显微微镜的保养由的保养由对应学号学号的同学的同学负责。实验过程中如果所用程中如果所用显微微镜不能使用，不能使用，自行与其他同学自行与其他同学调节。但。但显微微镜如果如果出出现问题，由，由对应学号的同学承担学号的同学承担责任。任。四、四、实验操作步操作

11、步骤基本形基本形态：杆菌，球菌：杆菌，球菌（注意大小、染色性、（注意大小、染色性、排列）排列）特殊特殊结构：构：鞭毛，芽胞，鞭毛，芽胞，荚膜膜（先找到菌体，（先找到菌体，再仔再仔细观察特殊察特殊结构）构）四、四、实验操作步操作步骤（二）（二）细菌形菌形态的的观察（示教？）察（示教？）（三）革（三）革兰氏染色的操作方法氏染色的操作方法无菌操作无菌操作涂片涂片 干燥干燥 固定固定 染色染色 水洗水洗 干燥干燥 镜检镜检四、四、实验操作步操作步骤（1 1）涂片：）涂片：先在先在载玻片左右端各滴一滴生理玻片左右端各滴一滴生理盐水，分水，分别挑挑取取大大肠杆菌杆菌和和白色葡萄球菌白色葡萄球菌菌体于生理菌

12、体于生理盐水中水中涂片涂片（采用采用三区涂片法：三区涂片法：分分别将上述将上述2 2种菌液延伸至玻片中央，种菌液延伸至玻片中央，混匀混匀并涂成薄膜），把菌液充分涂开，使其分布均匀。并涂成薄膜），把菌液充分涂开，使其分布均匀。注意：注意：载玻片要玻片要洁净无油迹无油迹；滴生理；滴生理盐水和取菌水和取菌不宜不宜过多多，涂片要涂片要均匀均匀，不可不可过于于浓厚厚。（三）革（三）革兰氏染色的操作方法氏染色的操作方法三区涂片法三区涂片法载玻片生理盐水滴菌体涂片大肠杆菌大肠杆菌葡萄球菌葡萄球菌混合菌混合菌染色前染色前必必须固定固定细菌，其目的是：菌，其目的是：一是一是杀死死细菌并使菌体菌并使菌体粘附粘附于

13、玻片上。于玻片上。二是二是增加其增加其对染料的染料的亲和和力。常用的有力。常用的有加加热和化学固定两种方法。固定和化学固定两种方法。固定时尽尽量量维持持细胞原有的形胞原有的形态。（三）革（三）革兰氏染色的操作方法氏染色的操作方法干燥：干燥：把上面涂好的片于把上面涂好的片于室温下自然干燥室温下自然干燥(或者用吹或者用吹风机机)。固定固定：涂面朝上涂面朝上，在，在火焰火焰上方上方过几次以几次以热固定菌体（此固定菌体（此操作的目的是使得操作的目的是使得细胞胞质凝固，以固定凝固，以固定细胞形胞形态，并使之，并使之牢固附着在牢固附着在载玻片上）。固定玻片上）。固定时通通过火焰火焰1212次次即可。即可。

14、注意：不可注意：不可过热，以，以载玻片不玻片不烫手手为宜，温度宜，温度过高会改高会改变甚甚至破坏至破坏细胞形胞形态。初染：初染：滴数滴滴数滴结晶紫晶紫于菌膜上（以于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜好完全覆盖菌膜为宜）初染宜）初染1-21-2分分钟minmin，水洗水洗。媒染媒染：滴加：滴加碘液碘液冲去残水，并覆盖冲去残水，并覆盖约1min1min，水洗水洗。（三）革（三）革兰氏染色的操作方法氏染色的操作方法初染初染媒染媒染脱色脱色复染复染脱色脱色：用：用滤纸吸去吸去载玻片上面的残水，将玻片玻片上面的残水，将玻片倾斜，用斜，用9595酒精酒精滴洗滴洗至流出酒精至流出酒精刚刚不出不出现紫色紫色时为止，止

15、，约2030s2030s，立即，立即用水冲用水冲净酒精。酒精。注意：注意：革革兰氏染色氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个果是否正确，乙醇脱色是整个操作的操作的关关键环节，脱色，脱色不足不足，阴性菌被，阴性菌被误染成阳染成阳性菌（性菌（假阳性假阳性），脱色），脱色过度，阳性菌被度，阳性菌被误染成阴染成阴性菌。性菌。（三）革（三）革兰氏染色的操作方法氏染色的操作方法复染复染：用：用番番红液染液染12min12min,水洗。水洗。镜检：干燥后（室温下：干燥后（室温下晾干晾干），），观察（先在察（先在低倍低倍镜（40X40X），），然后在然后在油油镜（100X100X）下）下观察菌体察菌体细胞胞的形的

16、形态）。革）。革兰氏阴性菌呈氏阴性菌呈红色，革色，革兰氏阳性菌氏阳性菌呈紫色。呈紫色。注意：以分散开的注意：以分散开的细菌的革菌的革兰氏染色反氏染色反应为准，准，过于密集的于密集的细菌，常常呈假阳性。菌，常常呈假阳性。（三）革（三）革兰氏染色的操作方法氏染色的操作方法(10)(10)实验结果的果的记录：要求在用要求在用显微微镜观察（左眼察（左眼观察）的同察）的同时在在实验记录本上画下你所本上画下你所观察到察到的的细菌的形菌的形态。（三）革（三）革兰氏染色的操作方法氏染色的操作方法注意：实验结束后，把载玻片用酒精棉擦净，放入烧杯！注意：实验结束后，把载玻片用酒精棉擦净，放入烧杯！n本本实验每人做一每人做一张。n实验报告中要画告中要画图表示表示结果果（40X倍镜、100X油镜）。（三）革（三）革兰氏染色的操作方法氏染色的操作方法思考题思考题1.1.涂片涂片为何要固定？固定加何要固定？固定加热时间过长会怎会怎样2.2.革革兰氏染色中哪一步是关氏染色中哪一步是关键，为什么？你如什么？你如何控制何控制这一步？一步？3.3.使用油使用油镜时，为什么必什么必须用香柏油？用香柏油？