实验二淀粉酶活性的测定.ppt

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1、 Please be quiet,上课了！上课了！4/23/2023生物化学实验 淀粉酶活性的测定淀粉酶活性的测定实实 验验 二二学时：学时：3 34/23/2023生物化学实验 1 1、学习并掌握植物体内淀粉酶活性测定、学习并掌握植物体内淀粉酶活性测定 的原理和方法。的原理和方法。2 2、掌握、掌握，-两种淀粉酶的理化特性。两种淀粉酶的理化特性。一、实验一、实验目的目的：4/23/2023生物化学实验 二、实验原理二、实验原理:淀粉淀粉是植物生长期间以淀粉粒形式存在于是植物生长期间以淀粉粒形式存在于细胞的储存多糖。种子、块茎、块根器官含量细胞的储存多糖。种子、块茎、块根器官含量丰富。丰富。天

2、然淀粉含两种组分：直链和支链淀粉。天然淀粉含两种组分：直链和支链淀粉。多数淀粉含直链与支链淀粉的比例多数淀粉含直链与支链淀粉的比例(20(202525)：(75(758080)。4/23/2023生物化学实验 NRERE直链淀粉直链淀粉直链淀粉的螺旋结构直链淀粉的螺旋结构0.8nm1.4nm6个残基个残基RENRE(1-6)分支点分支点支链淀粉或糖原分子示意图支链淀粉或糖原分子示意图支链淀粉或糖原分支点的结构支链淀粉或糖原分支点的结构-淀粉酶断裂淀粉酶断裂产生游离麦芽糖产生游离麦芽糖4/23/2023生物化学实验 酶（酶（enzyme）是具有高效性与专一性的生物催化剂是具有高效性与专一性的生物

3、催化剂（biological catalyst）。）。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。特点：特点：1、酶具有高效性（、酶具有高效性（high catalytic power）2、酶具有专一性（、酶具有专一性（specifity）4/23/2023生物化学实验 酶活性（酶活性（emzyme activity）指酶催化特定化学反应的能力，其大指酶催化特定化学反应的能力，其大小可用一定条件下小可用一定条件下酶促反应速度酶促反应速度来表示，来表示，酶促反应速度可用单位时间内底物的减少酶促反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。量或产物的增加量来表示。4/23

4、/2023生物化学实验 淀粉酶能催化淀粉水解为麦芽糖。植物淀粉酶能催化淀粉水解为麦芽糖。植物中淀粉酶有两种，各有其不同的理化特性。中淀粉酶有两种，各有其不同的理化特性。-淀粉酶淀粉酶耐热不耐酸，耐热不耐酸，7070加热加热15min15min仍保仍保持其活性持其活性,pH,pH3.63.6时钝化；而时钝化；而-淀粉酶淀粉酶耐耐酸不耐热，酸不耐热，7070加热加热15min15min则钝化。据此钝则钝化。据此钝化其中之一，即可测出另一种酶的活性。化其中之一，即可测出另一种酶的活性。4/23/2023生物化学实验 本本实实验验采采用用加加热热法法钝钝化化-淀淀粉粉酶酶，测测定定-淀淀粉粉酶酶的的活

5、活性性。具具体体方方法法是是利利用用3,5-3,5-二二硝硝基基水水杨杨酸酸比比色色法法来来测测定定淀淀粉粉酶酶水水解解生生成成的的麦麦芽芽糖糖的的含含量量，以以单单位位时时间间淀淀粉粉酶酶分分解解生生成成麦麦芽糖的量来表示淀粉酶活性的大小。芽糖的量来表示淀粉酶活性的大小。4/23/2023生物化学实验 在在碱碱性性，加加热热条条件件下下，还还原原糖糖与与3,5-3,5-二二硝硝基基水水杨杨酸酸(DNS)(DNS)反反应应，还还原原糖糖被被氧氧化化成成糖糖酸酸，DNSDNS被被还还原原为为棕棕红红色的色的3-3-氨基氨基-5-5-硝基水杨酸硝基水杨酸。3-3-氨基氨基-5-5-硝基水杨酸硝基水

6、杨酸(棕红色棕红色,A,A540540)3,5-3,5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸 (DNS)(DNS)4/23/2023生物化学实验 1、实验材料：、实验材料：萌发的小麦种子萌发的小麦种子 2、仪器：仪器：(1)可见分光光度计可见分光光度计 (2)恒温水浴锅恒温水浴锅 (3)离心机离心机 (4)刻度试管刻度试管 3、试剂：、试剂：(1)0.4M NaOH；(2)1%淀粉；淀粉；(3)3,5-二硝基水杨酸；二硝基水杨酸；(4)麦芽糖标准溶液麦芽糖标准溶液(1mg/ml)(5)0.1M pH=5.6的柠檬酸缓冲液。的柠檬酸缓冲液。三、实验材料、仪器和试剂：三、实验材料、仪器和试剂：4/23/202

7、3生物化学实验 四、实验步骤四、实验步骤1.麦芽糖标准曲线的制作麦芽糖标准曲线的制作 取取5支干净的具塞刻度试管，编号，按表支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：加入试剂：表表1 麦芽糖标准曲线制作麦芽糖标准曲线制作试 剂管 号12345麦芽糖标准液（mL）00.51.01.52.0蒸馏水（mL）2.01.51.00.50麦芽糖含量（mg/ml）00.250.50.751.03,5-二硝基水杨酸（mL）2.02.02.02.02.0 沸水浴5min，流水冷却，蒸馏水定容至20ml，摇匀，测定540nm处吸光度吸光度值04/23/2023生物化学实验 以以1号管作为空白调零点号管作为空白调

8、零点，在，在540 nm波长下波长下比色测定光密度。比色测定光密度。以麦芽糖浓度（以麦芽糖浓度（mg/ml）为横）为横坐标，坐标，A540nm为纵坐标，绘制标准曲线（通过为纵坐标，绘制标准曲线（通过Excel线性回归曲线和回归方程）。线性回归曲线和回归方程）。4/23/2023生物化学实验 2、酶液的制备、酶液的制备：称称取取1.0 g(记记录录实实际际质质量量)萌萌发发的的小小麦麦种种子子 于于研研钵钵中中，加加2ml水水及及少少许许石石英英砂砂，研研成成匀匀浆浆转转入入离离心心管管用用6ml蒸蒸馏馏水水分分三三次次洗洗涤涤研研钵钵均均转转入入离离心心管管用用玻玻璃璃棒棒搅搅动动20min等

9、等重重 4000r/min离离心心10min上上清清夜夜转转入入50ml容容量量瓶瓶定定容容，此此提提取取液液为为淀淀粉粉酶酶原原液液，用用于于-淀淀粉粉酶酶活活性性和和淀淀粉粉酶酶总总活活力力测定。测定。4/23/2023生物化学实验 3、-淀粉酶活性的测定：淀粉酶活性的测定：（1）取取两两支支试试管管一一支支对对照照，一一支支测测定定各各加加淀淀粉粉酶酶原原液液1ml70准准 确确 加加 热热 15min冷冷 却却 向向 对 照 管 加加4ml0.4MNaOH，终止酶活性；，终止酶活性；（2）向各管中均加入柠檬酸缓冲液）向各管中均加入柠檬酸缓冲液1ml；（3）测定管和对照管于）测定管和对照

10、管于40水浴水浴15min均加入均加入2ml 40预预热的淀粉热的淀粉立即立即40水浴保温水浴保温5min取出后迅速向测定管取出后迅速向测定管加入加入4ml 0.4M NaOH；4/23/2023生物化学实验 （4 4）取取对对照照管管和和测测定定管管中中溶溶液液各各2ml2ml,分分别别加加入入到到刻刻度度试试管管中中各各加加2ml2ml 3,5-3,5-二二硝硝基基水水杨杨酸酸沸沸水水浴浴5min5min冷冷却却稀稀释释至至20ml20ml刻刻度度混混匀匀以以制制作作麦麦芽芽糖糖标标准准曲曲线线的的1 1号号试试管管为为参参比比溶溶液液，调调“零零”，测定测定540nm540nm处吸光度处

11、吸光度记录结果。记录结果。4/23/2023生物化学实验 4、淀粉酶总活力的测定、淀粉酶总活力的测定（1）取两支试管一支对照，一支测定）取两支试管一支对照，一支测定各加各加 酶液酶液1ml，向对照管加，向对照管加4ml 0.4MNaOH，以钝化，以钝化 酶的活性；酶的活性；（2）向各管中均加入柠檬酸缓冲液）向各管中均加入柠檬酸缓冲液1ml；（3）测定管和对照管于）测定管和对照管于40水浴水浴15min均加入均加入2ml 40预热的淀粉预热的淀粉立即立即40水浴保温水浴保温5min取出取出 后迅速向测定管加入后迅速向测定管加入4ml 0.4M NaOH；4/23/2023生物化学实验 （3）取对

12、照管和测定管中溶液各）取对照管和测定管中溶液各2ml，分别加入，分别加入到刻度试管中到刻度试管中各加各加2ml 3,5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸沸水沸水浴浴5min冷却冷却稀释至稀释至20ml刻度刻度混匀混匀以制作以制作麦芽糖标准曲线的麦芽糖标准曲线的1号试管为参比溶液，调号试管为参比溶液，调“零零”，测定测定540nm处吸光度处吸光度记录结果。记录结果。4/23/2023生物化学实验 通过标准曲线或线性回归方程获得相应的麦芽糖含量（通过标准曲线或线性回归方程获得相应的麦芽糖含量（mg/ml），按下列），按下列公式计算公式计算-淀粉酶和淀粉酶和-淀粉酶的活力。淀粉酶的活力。-淀粉酶活力淀粉酶活

13、力（麦芽糖毫克数（麦芽糖毫克数/样品鲜重样品鲜重5分钟）分钟）=（A2-A1）VDW其中：其中：A2：为测定试管中：为测定试管中-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）；）；A1：为对照管中麦芽糖的浓度（：为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml）。）。V：为酶促反应体积；：为酶促反应体积；D：为酶液总体积。：为酶液总体积。W:样品鲜重样品鲜重五、实验结果与计算：五、实验结果与计算：4/23/2023生物化学实验 （）淀粉酶总活性）淀粉酶总活性（麦芽糖毫克数（麦芽糖毫克数/样品鲜重样品鲜重5分钟）分钟）=（B2-B1）VD样品鲜重样品鲜重B2：为（：为（+）淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（）淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）；）；B1：为对照管中麦芽糖的浓度（：为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml）；）；V：为酶促反应体积；：为酶促反应体积；D：为酶液总体积。：为酶液总体积。-淀粉酶活力淀粉酶活力（）淀粉酶总活性）淀粉酶总活性-淀粉酶活性淀粉酶活性4/23/2023生物化学实验 六、思考题：六、思考题：1 1、分析本实验的误差；、分析本实验的误差；2 2、植物中两种淀粉酶特性。、植物中两种淀粉酶特性。4/23/2023生物化学实验 终于下课了！终于下课了！4/23/2023生物化学实验