实验8考马斯亮蓝染色显示细胞骨架.ppt

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1、实验实验 8 8 考马斯亮蓝染色显示细胞骨架考马斯亮蓝染色显示细胞骨架1、了解细胞骨架成分显示方法的原理和操作步骤；、了解细胞骨架成分显示方法的原理和操作步骤；2、观察微丝在细胞中的分布。、观察微丝在细胞中的分布。一、实验目的一、实验目的2023/4/231细胞骨架的概念胞骨架的概念为真核真核细胞胞胞胞质中的蛋白中的蛋白质构成的构成的纤维系系统，在，在细胞的形胞的形态维持、持、细胞的运胞的运动、物、物质运运输和和细胞分裂中胞分裂中发挥重要作用。三种重要作用。三种组成成分：成成分：微微丝、微管、微管、中等中等纤维非肌非肌细胞中的微胞中的微丝是是动态结构，肌构，肌动蛋白蛋白单体（体（G-G-act

2、inactin）与）与纤维（F-actinF-actin）在一定条件下互相）在一定条件下互相转化。本化。本实验中中M-M-缓冲液提供的离子条件可使冲液提供的离子条件可使F-actinF-actin稳定。定。二、实验原理二、实验原理2023/4/232中等纤维中等纤维微管微管微丝微丝2023/4/233二、实验原理二、实验原理考考马斯亮斯亮蓝R250(Coomassie blue R250)R250(Coomassie blue R250)是一种蛋白是一种蛋白质染染料，不能特异地料，不能特异地显示示细胞骨架蛋白。用含非离子型去垢胞骨架蛋白。用含非离子型去垢剂TritonX-100TritonX-

3、100的的缓冲液冲液处理理细胞，可将胞，可将细胞的膜胞的膜结构和部分构和部分蛋白蛋白质抽提掉，但抽提掉，但细胞骨架系胞骨架系统的蛋白的蛋白质却被保留，用考却被保留，用考马斯亮斯亮蓝R 250R 250染色后，在光学染色后，在光学显微微镜下可下可见一种网状一种网状结构，构，其主要成分其主要成分为直径直径40nm40nm左右的微左右的微丝束。束。观察察时可可能能会会发现细胞胞膜膜上上有有些些孔孔洞洞，甚甚至至有有些些细胞胞变空空了了，这可可能能是是由由于于Triton Triton X-100X-100处理理时间过久久破破坏坏细胞胞结构所致。构所致。2023/4/234培养的成纤维细胞用培养的成纤

4、维细胞用Coomassie blue染色的结果染色的结果2023/4/235显示细胞骨架成分的特异性方法显示细胞骨架成分的特异性方法1 1、特异性的药物结合反应：、特异性的药物结合反应：如罗丹明标记的鬼笔环肽，可以显示微丝如罗丹明标记的鬼笔环肽，可以显示微丝2 2、免疫细胞化学方法：、免疫细胞化学方法：制备细胞骨架蛋白的特异性抗体，用免疫制备细胞骨架蛋白的特异性抗体，用免疫荧光、免疫酶标的方法显示细胞骨架荧光、免疫酶标的方法显示细胞骨架2023/4/236免疫荧光染色免疫荧光染色左：微丝，中：微管左：微丝，中：微管，右：中等纤维，右：中等纤维2023/4/237三、实验用品三、实验用品 复式复

5、式显微微镜（带油浸物油浸物镜）擦擦镜纸（lens paper）；记号号笔笔；小小片片滤纸；载玻玻片；盖玻片；剪刀；片；盖玻片；剪刀；镊子；洋葱子；洋葱鳞茎茎 1%TritonX-100；M缓冲液；冲液；3%戊二戊二醛；pH6.8 磷酸磷酸缓冲液；冲液；0.2%考考马斯亮斯亮蓝R-250染色液染色液2023/4/238四、实验步骤四、实验步骤1用镊子撕取洋葱鳞茎内侧的表皮，剪成约用镊子撕取洋葱鳞茎内侧的表皮，剪成约1cm见方。见方。置于置于pH6.8的磷酸缓冲液中，使其下沉的磷酸缓冲液中，使其下沉（每人做每人做2片，片，不要太大，否不要太大，否则不易展开）不易展开）。2吸弃磷酸缓冲液，用吸弃磷酸

6、缓冲液，用1%TritonX-100处理处理20 mins。对照组使用对照组使用M缓冲液处理。缓冲液处理。3M缓冲液洗缓冲液洗5 mins X 3 times43%戊二醛固定戊二醛固定30 min（或（或Carnoy固定液）固定液）5磷酸缓冲液洗磷酸缓冲液洗5 mins X 3 times。60.2%考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色30 mins，蒸馏水冲液洗一次，蒸馏水冲液洗一次，5分钟。然后将表皮（带少量液体）平铺在载玻片上，加分钟。然后将表皮（带少量液体）平铺在载玻片上，加盖玻片，显微镜下观察。盖玻片，显微镜下观察。2023/4/239洋葱表皮细胞（200倍）五、实验结果五、实验结果2023

7、/4/2310洋葱表皮细胞（400倍）五、实验结果五、实验结果2023/4/2311洋葱表皮细胞（对照组，100倍）五、实验结果五、实验结果2023/4/2312五、实验结果五、实验结果2023/4/2313六、六、实验报告告1.简单画出所画出所观察到的察到的图像（包括像（包括对照）的并分析。照）的并分析。2.用用1%的的Triton X-100处理理细胞的作用是什么？胞的作用是什么？3.M缓冲液的作用是什么？冲液的作用是什么？2023/4/2314注意事注意事项洋洋葱葱鳞茎茎内内表表皮皮不不必必剪剪得得过大大，否否则很很难平平整整地地铺开开在在载玻片上，而是部分重叠着，影响玻片上，而是部分重叠着，影响观察效果。察效果。另另外外，在在用用高高倍倍镜观察察之之前前要要盖盖上上盖盖玻玻片片，如如果果载玻玻片片上上较干干，最最好好先先滴滴上上一一滴滴水水后后再再盖盖盖盖玻玻片片，以以免免造造成成很很多多气气泡，影响泡，影响观察效果。察效果。染色染色时间不宜不宜过长，否，否则会染色会染色过甚反而甚反而观察效果不佳。察效果不佳。用用1%Triton 1%Triton X-100X-100抽抽提提杂蛋蛋白白的的时间要要控控制制好好，时间长将将破坏破坏细胞胞结构，抽提构，抽提时间短背景干短背景干扰大，影响大，影响观察效果。察效果。2023/4/2315