微生物发酵产酶技术.pptx

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1、 微生物发酵产酶技术 任务分配 PPT讲解人：张建华 问题讲解：梅延超、张娜、李虎教学目标教学目标u产酶微生物及其保藏u酶的发酵生产工艺u提高酶产量的措施（一）利用微生物产酶的优点1.微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。2.微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。3.微生物培养基来源广泛、价格便宜。4.可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。5.可以利用以基因工程为主的近代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。（二）常用产酶微生物的要求1.不是致病菌，不产生有毒物质的微生物，在系统发育上最好是与病原体无关；这样才能确保酶生产和应用

2、的安全；2.能够利用廉价原料，能在便宜的底物上良好生长，繁殖快,发酵周期短，产酶量高；3.菌种不易变异退化，产酶性能稳定，不易感染噬菌体；4.产生的酶容易分离纯化，最好选用产生胞外酶的菌种，有利于酶的分离，回收率高；5.对医药和食品用酶，应考虑其安全性。一、产酶微生物及其保藏（一）常用产酶微生物工业中常用的产酶微生物主要包括细菌、放线菌、真菌、酵母等。其中不少性能优良的微生物菌株已经在酶的发酵生产中广泛应用。常用的产酶微生物类别菌种名称产酶种类细菌枯草芽孢杆菌-淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等大肠杆菌谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、-半乳糖苷酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等放线菌链霉菌葡萄糖

3、异构酶、纤维素、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等真菌米曲霉糖化酶、蛋白酶、氨基酰化酶、果胶酶等青霉葡萄糖氧化酶、纤维素酶Cx、脂肪酶、核酸酶P1等木霉纤维素酶C1、纤维二糖酶等根霉糖化酶、-淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶等毛霉蛋白酶、脂肪酶、凝乳酶等黑曲霉过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、橙皮苷酶、柚皮苷酶等酵母啤酒酵母转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等假丝酵母脂肪酶、尿激酶、尿囊素酶、等（二）菌种的保藏 酶制剂生产工业中，生产菌种（微生物）的产酶能力的退化是常发生的。为防止菌种退化，一是尽量减少传代次数，二是做好菌种保藏工作。菌种保藏的方法很多，其基本原理是采用低温、干燥、绝氧等条件抑制菌种的代谢活动，使之停止繁

4、殖，处于休眠状态。常用的菌种保藏方法有：1.斜面冰箱保藏法：实验室最常用的一种保藏方法，适于保藏 细菌、放线菌、酵母菌及霉菌等。将不同菌种接种在适宜的斜面培养基上，在适宜的温度下培养，使其充分生长，培养好的菌种置于45。C冰箱中进行保藏。2.砂土保藏最适合于霉菌、芽孢杆菌、放线菌等的保藏，方法简便易行，般可保存数年至数十年。3.液体石蜡油封法：将灭菌过的液体石蜡注入菌种斜面试管中，以隔绝氧气并防止水分蒸发，抑制细胞代谢从而达到延长保藏期的目的。此法适于保藏霉菌、酵母菌、可保藏菌种打1-2年，且操作简单易行，但有些细菌（如固氮菌、乳酸杆菌、分枝杆菌和毛霉、根霉等）不宜用此法保存。4.冰冻干燥法：

5、大多数微生物都可用冰冻干燥法来保藏，冰冻干燥是利用真空下结冰状态的水分子直接升华汽化而使样品干燥的。此法适用于绝大多数的微生物，保藏期长，有时可达15年以上。在冰冻和脱水过程中为防止对细胞造成损害，可用脱脂牛奶等作为保护剂来制备细胞悬液。5.液态超低温保藏法：将细胞在有甘油等保护剂存在下，先置冰箱中逐渐降温，然后置液氮中储藏。此法可长期保存菌种。二、酶的发酵生产工艺酶发酵生产的目的是获得大量所需要的酶。因此，除了选择性能优良的产酶细胞以外，还必须满足细胞生长、繁殖和发酵产酶的各种工艺条件，并需要根据发酵过程的变化进行优化控制。酶发酵生产的一般工艺流程如下：细胞固定化酶保藏菌种菌种活化种子扩大培

6、养制备原生质体发酵分离纯化预培养原生质体固定化灭菌培养基无菌空气（一）菌种活化与扩大培养1.菌种活化生产上为了防止菌种退化，一般都采用各种方法保藏菌种。保藏的菌种活性很低，处于休眠状况，使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动，这一过程称为菌种活化。2.菌种的扩大培养扩大培养是为了将活化了的细胞再经过扁平或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种的过程。（二）发酵培养基的配制1.培养基的基本组分培养基的组成成分因所培养的生物和目的酶不同而各有差别。但是，各种培养基都包括碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。2.微生物发酵产酶常用的几种发酵培养基

7、（1）枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基玉米粉8，豆饼粉4，磷酸氢二钠08，硫酸铵0.4，氯化钙0.2，氯化铵0.15（自然pH）。（2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基玉米粉4，豆饼粉3，麸皮3.2，糠1，磷酸氢二钠0.4，磷酸二氢钾0.03（自然pH）。（三）发酵方式酶的发酵方式根据微生物培养方式的不同，可以分为固体发酵、液体深层发酵和固定化细胞发酵等。1.固体发酵法指微生物在含有吸附水分而非游离水的潮湿固体上生长。在酿酒工业的糖化曲和调料工业的酸性蛋白酶，特别适用于各种霉菌发酵产酶。其最大特点是固体曲的酶活力高。主要的固体发酵法有浅盘法、转桶法、后层发酵法等。2.深层液体发

8、酵法是采用液体培养基，置于发酵容器中，经灭菌、冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。此法不仅适用于微生物细胞，也可用于各种植物细胞和动物细胞的悬浮培养和发酵。3.固定化细胞发酵法又称为固定化细胞或固定化增值细胞，是采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。（四）发酵条件的调控1.PH在配制培养基时应根据微生物的需要调节pH值。一般情况下，多数细菌、放线菌生长的最适pH 为中性至微碱性（）；而霉菌、酵母的最适生长pH值则偏酸性（pH4-6）；植物细胞生长的最适pH值为 5-6；培养基的pH值不仅影响微生物的生长和产酶，而且对酶的分泌也有作用。常用的方法有根据P

9、H值的变化情况加酸或是加碱进行调节，也可以通过发酵过程中不了来控制PH。2.温度有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度往往有所不同，而且往往低于生长最适温度。原因是在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。3.溶解氧溶解氧是指溶解在培养基中的氧气。在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧。溶解氧的调节控制，就是要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断地进行补充，使培养基中溶解氧的量保持恒定。（1）调节溶解氧的方法主要有：a.调节通气量增大通气量，可以提高溶氧速率。减少通气量，则使溶氧速率降低。在发酵生产过程在发酵生产过程中，应尽量

10、控制中，应尽量控制溶氧速率等于或溶氧速率等于或稍高于耗氧速率。稍高于耗氧速率。b.调节氧分压u增加发酵容器中的空气压力u增加通入空气中的氧含量u都能提高氧分压，从而使溶氧速率提高。c.调节气液接触时间u增加液层高度u降低气流速度u在反应器中增设挡板u延长空气流经培养液的距离d.改变培养液的性质u改变培养液的组分或浓度，有效地降低培养液的黏度u设置消泡装置或添加适当的消泡剂e.调节气液接触面积u在发酵容器的底部安装空气分配管，使气体分散成小气泡进入培 养液中，是增加气液接触面积的主要方法u装设搅拌装置u增设挡板三、提高酶产量的措施在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产量，除了选育优良的产酶细胞外，

11、还可以采用一些与酶发酵工艺有关的措施，例如：1.添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。诱导物一般可以分为3类：（1）酶的作用底物 例如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物。（2）酶的反应产物 例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生。（3）酶作用底物的类似物 例如异丙基-D-硫代半乳糖昔（IPTG）对-半乳糖昔酶的诱导效果比乳糖高几百倍。其中使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物类似物。2.控制(降低)阻遏物的浓度微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。阻遏作用根据其作用机制的不同，可以分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物引起的阻遏作用。3.添加表面活性剂 由于它表面活性剂可以与细胞膜相互作用，改变(增加)了细胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打破了胞内酶合成的反馈平衡，有利于胞外酶的分泌，从而提高了酶的产量。此外，有些表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用，可以提高酶的活力，例如在霉菌的发酵生产中添加 1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。4.添加产酶促进剂产酶促进剂可以促进产酶，但作用机理并未阐明清楚。添加产酶促进剂往往对提高酶产量有显著效果。谢谢谢谢观观赏赏