工程菌精美生物医学.ppt

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1、第四节基因工程菌培养与发酵什么是基因工程菌？培养和发酵基因工程菌的目的是什么最常用的基因工程药物表达系统是什么？基因工程菌的发酵受到哪些条件的影响？一、概念工程菌是采用现代生物工程技术加工改造，被转入了外源目的基因的新型微生物具有多功能、高效和适应性强等特点。治理海洋石油泄漏生产基因工程药物培养和发酵的目的：外源基因能高水平表达，能获得大量外源基因产物【其实是指蛋白质的产生，表现出对应的作用】最常用的基因工程药物表达系统（工程菌体系）大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞二、工程菌生长繁殖需要的条件良好的物理环境:主要有发酵温度、PH值、溶氧量等。合适的化学环境:适宜工程菌生长代谢所需的各种营养物质的

2、浓度,并限制各种阻碍生长代谢的有害物质的浓度三、基因工程菌常用的发酵方法1、批式培养指营养物和工程菌株一次加入进行培养,直到培养结束放出,中间除了空气进入和尾气排出、酸碱调解PH值外与外部没有物料交换。传统的生物制品发酵多用此过程。2、流加式培养是一种发酵过程中优化化学环境的一种有效方法,在批式培养基础上,改善批式培养过程中由于营养物质的消耗造成的重组细胞营养不足,调整了工程菌所处的生长环境,使工程菌一直处于最佳状态 工工程程菌菌在在保保存存、发发酵酵过过程程中中不不稳稳定定，成成为为制制约约基基因因工工程程转转变变为为生生产产力力的的关关键键之之一。一。四、工程菌的稳定性四、工程菌的稳定性q

3、外在表现外在表现：得不到表达产物、或达不到要求产量。得不到表达产物、或达不到要求产量。q本质本质：质粒不稳定；表达产物不稳定。：质粒不稳定；表达产物不稳定。q内在表现内在表现：质粒丢失；重组质粒：质粒丢失；重组质粒DNA片段脱落。片段脱落。1、工程菌不稳定性的表现工程菌不稳定性的表现质粒丢失质粒丢失：由由环环境境因因素素或或生生理理、遗遗传传学学原原因因，质质粒粒从从宿宿主主中中丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。重组质粒上一部分片段脱落：重组质粒上一部分片段脱落：表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。表现为质粒变小或某些遗传信息发生

4、变化甚至丧失。表达产物不稳定表达产物不稳定：人人干干扰扰素素工工程程菌菌在在表表达达干干扰扰素素时时，随随着着培培养养时时间间的的延长，干扰素活性反而下降。延长，干扰素活性反而下降。影响工程菌稳定性的因素：影响工程菌稳定性的因素：（1）质质粒粒结结构构：质质粒粒稳稳定定区区受受到到影影响响，重重组组质质粒粒上上有重复序列等。有重复序列等。（2）宿宿主主：宿宿主主中中重重组组基基因因的的完完整整性性、重重组组时时有有关关基因的变异等。基因的变异等。（3）环环境境因因素素：高高温温、去去垢垢剂剂、某某些些药药物物(如如利利福福平平)、染染料料及及胸胸腺腺嘧嘧啶啶饥饥饿饿、紫紫外外线线辐辐射射等等都

5、都会会引引起起质质粒粒的的丢丢失。失。（1）组建合适载体）组建合适载体 构构建建质质粒粒时时，插插入入一一段段特特殊殊的的DNA片片段段或或基基因因，使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。（2）选择适当宿主）选择适当宿主 在在选选择择宿宿主主时时，须须确确定定其其遗遗传传特特点点。重重组组质质粒粒在在大大肠肠杆菌中较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。杆菌中较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。2、解决工程菌不稳定的对策解决工程菌不稳定的对策（3）施加选择压力）施加选择压力 a 抗生素添加法抗生素添加法 通通常常在在重重组组质质

6、粒粒上上含含抗抗药药性性基基因因。转转入入不不耐耐药药的的宿宿主主后后，工工程程菌菌获获得得了了抗抗药药性性。发发酵酵时时，培培养养基基中中加加入入抗抗生生素素，可阻止丢失质粒的非生产菌生长。可阻止丢失质粒的非生产菌生长。b 抗生素依赖变异法抗生素依赖变异法 诱诱变变使使宿宿主主成成为为某某抗抗生生素素的的依依赖赖性性突突变变株株，而而重重组组质质粒粒上上含含有有该该抗抗生生素素的的非非依依赖赖性性基基因因。发发酵酵生生产产时时，不不向向培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响。培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响。c、营养缺陷型法、营养缺陷型法 诱诱变变使使宿宿主主成成为

7、为营营养养缺缺陷陷型型，将将相相关关基基因因插插入入到到重重组组质质粒粒中中，选选择择基基础础培培养养基基使使失失去去重重组组质质粒粒的的细细胞胞不不能能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。（4）控制基因过量表达）控制基因过量表达 外外源源基基因因表表达达水水平平越越高高，重重组组质质粒粒越越不不稳稳定定，如如果果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢失。外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢失。可采取可采取两阶段培养法两阶段培养法。（5）控制培养条件）控制培养条件 众众多多环环境境因因素素中中，培培养养基基组组成成、培培养养温温度度、菌菌体体的

8、的比生长速率尤为重要。比生长速率尤为重要。对对一一个个已已经经组组建建完完成成的的克克隆隆菌菌来来说说，选选择择最最合合适适的的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。培养条件是进行工业化生产的关键步骤。（6）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性。）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性。五、基因工程菌生长代谢的特点 菌体的生长通常用菌体的生长通常用菌体的生长通常用菌体的生长通常用比生长速率比生长速率比生长速率比生长速率来来来来表示。表示。表示。表示。工程菌培养可通过选用工程菌培养可通过选用工程菌培养可通过选用工程菌培养可通过选用不同的碳不同的碳不同的碳不同的碳源源源源控制补料和稀释速率等方法来控制

9、控制补料和稀释速率等方法来控制控制补料和稀释速率等方法来控制控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。菌体的生长。菌体的生长。菌体的生长。大肠杆菌的蛋白大肠杆菌的蛋白大肠杆菌的蛋白大肠杆菌的蛋白/菌体量的比菌体量的比菌体量的比菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长值是基本恒定的，因而菌体的生长值是基本恒定的，因而菌体的生长值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。速度反映了蛋白质的合成速度。速度反映了蛋白质的合成速度。速度反映了蛋白质的合成速度。控制菌体的生长对提高质粒的控制菌体的生长对提高质粒的控制菌体的生长对提高质粒的控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、

10、提稳定性、减少代谢副产物积累、提稳定性、减少代谢副产物积累、提稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。高外源蛋白产率有重要意义。高外源蛋白产率有重要意义。高外源蛋白产率有重要意义。（一）菌体的生长与能量的关系（一）菌体的生长与能量的关系（一）菌体的生长与能量的关系（一）菌体的生长与能量的关系碳源物质是组成培养基的主要成分碳源物质是组成培养基的主要成分碳源物质是组成培养基的主要成分碳源物质是组成培养基的主要成分当菌体生长所需能量大于菌体有氧代当菌体生长所需能量大于菌体有氧代当菌体生长所需能量大于菌体有氧代当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，谢提供的能量

11、时，菌体会产生乙酸，谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的导致培养基的导致培养基的导致培养基的pHpH值下降，从而影响菌值下降，从而影响菌值下降，从而影响菌值下降，从而影响菌体的生长。体的生长。体的生长。体的生长。适当提高适当提高适当提高适当提高pHpH，可减少乙酸的抑制作用，可减少乙酸的抑制作用，可减少乙酸的抑制作用，可减少乙酸的抑制作用 分批培养中选择不同的碳源，连分批培养中选择不同的碳源，连分批培养中选择不同的碳源，连分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范续培养中控制稀释速率等都能一定范续培养中控制稀释速率等都能一定范续培养中控

12、制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸围内控制菌体的生长，从而控制乙酸围内控制菌体的生长，从而控制乙酸围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。的产生，减少它的抑制作用。的产生，减少它的抑制作用。的产生，减少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减加入蛋氨酸和酵母提取物都能减加入蛋氨酸和酵母提取物都能减加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。少乙酸的产生。少乙酸的产生。少乙酸的产生。（二）菌体生长与前体供应的关系（二）菌体生长与前体供应的关系在基础培养基中加入氨基酸（小分子在基础培养基中加入氨基酸（小分子在基础培养基中加入氨基酸（小分子在基础培养基中加入氨基

13、酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白前体）能使菌体比生长率提高，蛋白前体）能使菌体比生长率提高，蛋白前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。合成增加。合成增加。合成增加。六、基因工程菌发酵六、基因工程菌发酵六、基因工程菌发酵六、基因工程菌发酵（一）基因工程菌的培养过程（一）基因工程菌的培养过程（一）基因工程菌的培养过程（一）基因工程菌的培养过程 通过摇瓶操作基因工程菌生长的基通过摇瓶操作基因工程菌生长的基通过摇瓶操作基因工程菌生长的基通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件础条件础条件础条件如温度、如温度、如温度、如温度、pHpHpHpH、培养基各种组分、碳氧、培养基各种组分、碳氧、培养基

14、各种组分、碳氧、培养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受比，分析表达产物的合成、积累对受比，分析表达产物的合成、积累对受比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响体细胞的影响体细胞的影响体细胞的影响;通过培养罐操作确定通过培养罐操作确定培养参数培养参数和和控制控制方案方案以及以及顺序顺序。菌种菌种菌种菌种菌种菌种 一级种子摇瓶一级种子摇瓶一级种子摇瓶一级种子摇瓶一级种子摇瓶一级种子摇瓶 二级种子罐培养二级种子罐培养二级种子罐培养二级种子罐培养二级种子罐培养二级种子罐培养 扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养 原料原料原料原料原料原料 发酵培养发酵培养发酵培养发酵培养发

15、酵培养发酵培养 灭菌灭菌灭菌灭菌灭菌灭菌 发酵生产发酵生产发酵生产发酵生产发酵生产发酵生产 代谢产物分离代谢产物分离代谢产物分离代谢产物分离代谢产物分离代谢产物分离 基配制基配制基配制基配制基配制基配制 微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图微生物工业发酵过程简图（二）基因工程菌的发酵工艺（二）基因工程菌的发酵工艺（二）基因工程菌的发酵工艺（二）基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌的发酵不仅涉及宿基因工程菌的发酵不仅涉及宿基因工程菌的发酵不仅涉及宿基因工程菌的发酵不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关主、载体和克隆基因之间的相互关主、载体和克隆基因之间的相互关主、载体

16、和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。系还和环境有关。系还和环境有关。系还和环境有关。工艺要求：外源基因既高效表工艺要求：外源基因既高效表工艺要求：外源基因既高效表工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。达，又有利于产品分离纯化。达，又有利于产品分离纯化。达，又有利于产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有：对发酵影响较大的几个因素有：对发酵影响较大的几个因素有：对发酵影响较大的几个因素有：培养基的影响培养基的影响培养基的影响培养基的影响接种量的影响接种量的影响接种量的影响接种量的影响温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响溶解氧的影响溶解氧的影响溶解氧的影响溶解氧的影响热诱导时机

17、的影响热诱导时机的影响热诱导时机的影响热诱导时机的影响pHpHpHpH的影响的影响的影响的影响 培养基的影响培养基的影响培养基的影响培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的培养基的组成既要提高工程菌的培养基的组成既要提高工程菌的培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，生长速率，又要保持工程菌的稳定性，生长速率，又要保持工程菌的稳定性，生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。使外源基因高效表达。使外源基因高效表达。使外源基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、

18、蛋白胨、常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。还有无机盐、维生素等。不同的碳源对菌体的生长和外源基因不同的碳源对菌体的生长和外源基因不同的碳源对菌体的生长和外源基因不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。表达有较大的影响。表达有较大的影响。表达有较大的影响。使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多糖菌体产生的副产品较多糖菌体产生的副产品较多糖菌体产生的副产品较多 在氮

19、源中，酪蛋白水解物有在氮源中，酪蛋白水解物有在氮源中，酪蛋白水解物有在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。利于产物的合成与分泌。利于产物的合成与分泌。利于产物的合成与分泌。无机磷在许多代谢反应中是无机磷在许多代谢反应中是无机磷在许多代谢反应中是无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影一个效应因子，磷浓度不同，影一个效应因子，磷浓度不同，影一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。响菌体生长。响菌体生长。响菌体生长。接种量的影响接种量的影响接种量的影响接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养接种量是指移入的种子液体积和培养接种量是指移入的种子液体积和培养接种量是指移入的种

20、子液体积和培养液体积的比例。液体积的比例。液体积的比例。液体积的比例。接种量的接种量的接种量的接种量的大小大小大小大小影响发酵的产量和发酵影响发酵的产量和发酵影响发酵的产量和发酵影响发酵的产量和发酵周期。周期。周期。周期。接种量接种量接种量接种量小小小小，菌体延迟期较长，使菌龄，菌体延迟期较长，使菌龄，菌体延迟期较长，使菌龄，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。老化，不利于外源基因表达。老化，不利于外源基因表达。老化，不利于外源基因表达。接种量接种量接种量接种量大大大大，可缩短生长延迟期，可缩短生长延迟期，可缩短生长延迟期，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生菌体迅速繁衍

21、，很快进入对数生菌体迅速繁衍，很快进入对数生菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。长期，适于表达外源基因。长期，适于表达外源基因。长期，适于表达外源基因。接种量接种量接种量接种量过高过高过高过高，使菌体生长过快，使菌体生长过快，使菌体生长过快，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后代谢物积累过多，反而会抑制后代谢物积累过多，反而会抑制后代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长期菌体的生长期菌体的生长期菌体的生长。温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响温度对基因表达的调控作用发温度对基因表达的调控作用发温度对基因表达的调控作用发温度对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小

22、分子调节分生在复制转录翻译和小分子调节分生在复制转录翻译和小分子调节分生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。子的合成等水平上。子的合成等水平上。子的合成等水平上。温度影响各种酶的反应速度，温度影响各种酶的反应速度，温度影响各种酶的反应速度，温度影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影改变菌体代谢产物的反应方向，影改变菌体代谢产物的反应方向，影改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。响代谢调控机制。响代谢调控机制。响代谢调控机制。溶解氧浓度（溶解氧浓度（溶解氧浓度（溶解氧浓度（DODO）的影响）的影响）的影响）的影响 对于好氧发酵对于好氧发酵对于好氧发酵对于好氧发酵,

23、溶解氧浓度是重溶解氧浓度是重溶解氧浓度是重溶解氧浓度是重要的参数。要的参数。要的参数。要的参数。好氧微生物利用溶解于培养液好氧微生物利用溶解于培养液好氧微生物利用溶解于培养液好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。中的氧气进行呼吸。中的氧气进行呼吸。中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用若能提高溶氧速度和氧的利用若能提高溶氧速度和氧的利用若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。率，则能提高发酵产率。率，则能提高发酵产率。率，则能提高发酵产率。发酵时，随发酵时，随发酵时，随发酵时，随DODODODO浓度的下降，细浓度的下降，细浓度的下降，细浓度的下降，细胞生长减慢。胞生长减慢。

24、胞生长减慢。胞生长减慢。外源基因的高效表达需要大量外源基因的高效表达需要大量外源基因的高效表达需要大量外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提的能量，促进细胞的呼吸作用，提的能量，促进细胞的呼吸作用，提的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。高对氧的需求。高对氧的需求。高对氧的需求。维持较高的维持较高的维持较高的维持较高的DODODODO值，才能提高工值，才能提高工值，才能提高工值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的程菌的生长，利于外源蛋白产物的程菌的生长，利于外源蛋白产物的程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。形成。形成。形成。采用调节搅拌转速的方法采用调节搅拌转速的

25、方法采用调节搅拌转速的方法采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高可改变培养过程中的氧供给，提高可改变培养过程中的氧供给，提高可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。活菌产量。活菌产量。活菌产量。热诱导时机的影响热诱导时机的影响热诱导时机的影响热诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长后期升温诱一般在对数生长期或对数生长后期升温诱一般在对数生长期或对数生长后期升温诱一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。导表达。导表达。导表达。要求在要求在要求在要求在2min2min内让罐升温达到内让罐升温达到内让罐升温达到内让罐升温达到42 42 。升温时间太长，会降低外源蛋白表达量，升温

26、时间太长，会降低外源蛋白表达量，升温时间太长，会降低外源蛋白表达量，升温时间太长，会降低外源蛋白表达量，也给提取纯化增加困难。也给提取纯化增加困难。也给提取纯化增加困难。也给提取纯化增加困难。pH pH pH pH的影响的影响的影响的影响 pH pH pH pH对细胞的正常生长和外源蛋对细胞的正常生长和外源蛋对细胞的正常生长和外源蛋对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以白的高效表达都有影响，所以白的高效表达都有影响，所以白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情应根据工程菌的生长和代谢情应根据工程菌的生长和代谢情应根据工程菌的生长和代谢情况，对况，对况，对况，对pHpHp

27、HpH进行适当的调节。进行适当的调节。进行适当的调节。进行适当的调节。如采取两段培养工艺，培养前如采取两段培养工艺，培养前如采取两段培养工艺，培养前如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条期重点是优化工程菌的生长条期重点是优化工程菌的生长条期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳件，其最佳件，其最佳件，其最佳pHpHpHpH在在在在6.86.86.86.87.47.47.47.4左右左右左右左右;培养后期重点是优化外源蛋白培养后期重点是优化外源蛋白培养后期重点是优化外源蛋白培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件的表达条件的表达条件的表达条件,其最佳其最佳其最佳其最佳pHpHpHpH为为为

28、为6.06.06.06.06.56.56.56.5。（三）基因工程菌的培养设备（三）基因工程菌的培养设备（三）基因工程菌的培养设备（三）基因工程菌的培养设备 微生物发酵目的是为了获得初级或次微生物发酵目的是为了获得初级或次微生物发酵目的是为了获得初级或次微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标级代谢产物，细胞生长并非主要目标级代谢产物，细胞生长并非主要目标级代谢产物，细胞生长并非主要目标应用发酵罐大规模培养基因工程菌是应用发酵罐大规模培养基因工程菌是应用发酵罐大规模培养基因工程菌是应用发酵罐大规模培养基因工程菌是为了为了为了为了获得最大量的基因表达产物获得最大量的基因表

29、达产物获得最大量的基因表达产物获得最大量的基因表达产物。发酵罐的组成有：发酵罐的组成有：发酵罐的组成有：发酵罐的组成有：发酵罐体发酵罐体发酵罐体发酵罐体保证高传质作用的搅拌器保证高传质作用的搅拌器保证高传质作用的搅拌器保证高传质作用的搅拌器精细的温度控制和灭菌系统精细的温度控制和灭菌系统精细的温度控制和灭菌系统精细的温度控制和灭菌系统空气无菌过滤装置空气无菌过滤装置空气无菌过滤装置空气无菌过滤装置残留气体处理装置残留气体处理装置残留气体处理装置残留气体处理装置参数测量与控制系统参数测量与控制系统参数测量与控制系统参数测量与控制系统培养液配制和连续操作系统。培养液配制和连续操作系统。培养液配制和

30、连续操作系统。培养液配制和连续操作系统。发酵罐要求：发酵罐要求：发酵罐要求：发酵罐要求：提供菌体生长最适生长条件，提供菌体生长最适生长条件，提供菌体生长最适生长条件，提供菌体生长最适生长条件，培养过程不得污染，培养过程不得污染，培养过程不得污染，培养过程不得污染，保证纯菌培养，保证纯菌培养，保证纯菌培养，保证纯菌培养，培养及消毒过程不得游离异物，培养及消毒过程不得游离异物，培养及消毒过程不得游离异物，培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等不能干扰细菌代谢活动等不能干扰细菌代谢活动等不能干扰细菌代谢活动等。补充：菌种保藏 菌种是国家的重要资源。菌种是国家的重要资源。任务任务:不死亡、

31、不污染、不退化。不死亡、不污染、不退化。1980年年，中中国国微微生生物物菌菌种种保保藏藏委委员员会会成成立。立。一、一、菌种保藏的意义菌种保藏的意义原理：原理：人人工工创创造造条条件件使使微微生生物物的的代代谢谢尽尽量量降降低低，以以减减少少变变异异。一一般般可可通通过过限限制制营营养养、缺缺氧氧，干干燥燥和和低低温温，使使菌菌种种处处于于“体体眠眠”状态。状态。二、二、菌种保藏原理和方法菌种保藏原理和方法（一）（一）斜面冰箱保藏斜面冰箱保藏 4冰箱保存。保存期冰箱保存。保存期1-3月。月。（二）（二）沙土管保藏法沙土管保藏法 适合于产孢子或芽孢的微生物。适合于产孢子或芽孢的微生物。保存期保

32、存期1年左右。年左右。（三）（三）菌丝速冻法菌丝速冻法 不产孢子或芽孢的微生物可用甘油菌丝速冻法。不产孢子或芽孢的微生物可用甘油菌丝速冻法。保保藏藏温温度度为为20，为为避避免免损损伤伤致致死死，需需甘甘油油作作保保护护剂。甘油最终浓度为剂。甘油最终浓度为25。（四）（四）石蜡油封存法石蜡油封存法 向向菌菌种种斜斜面面上上，倒倒入入一一层层灭灭菌菌石石蜡蜡油油，量量高高出出斜斜面面1cm，保存冰箱中。，保存冰箱中。适于不能利用石蜡油作碳源的微生物。适于不能利用石蜡油作碳源的微生物。保存期约保存期约1年。年。（五五）真真空空冷冷冻冻干干燥燥保保藏藏法法 基基本本原原理理：在在较较低低温温度度下下

33、(-18)，快快速速地地将将细细胞胞冻冻结结，并并且且保保持持细细胞胞完完整整，然然后后在在真真空空中中使使水水分分升升华华。在在这这样样的的环环境境中中，微微生生物物的的生生长长和和代代谢谢暂时停止，不易发生变异。暂时停止，不易发生变异。菌种可保存菌种可保存5年左右。年左右。（六）（六）液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 是是近近几几年年才才发发展展起起来来的的，国国外外已已较较普普遍遍采采用用，适适用用范范围围最最广广。尤尤其其是是一一些些不不产产孢孢子子的的菌菌丝丝体体，用用其其他他保保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。（1）原理）原理

34、 液液氮氮的的温温度度可可达达-196，远远远远低低于于新新陈陈代代谢谢作作用用停停止的温度止的温度(-130)，菌种代谢活动停止，化学作用消失。，菌种代谢活动停止，化学作用消失。（2）操作）操作 a 安瓿管安瓿管 需需能能承承受受大大温温差差而而不不至至于于破破裂裂，加加棉棉塞塞后后灭灭菌菌，烘烘干干后备用。后备用。b 菌种准备及分装菌种准备及分装 超超低低温温冷冷冻冻过过程程需需要要保保护护剂剂。常常用用保保护护剂剂为为10甘甘油油，制备好菌液后，加入安瓿管，装量制备好菌液后，加入安瓿管，装量0.21mL。c 冻结冻结 关关键键是是把把微微生生物物从从常常温温过过渡渡到到低低温温。这这样样

35、在在细细胞胞接接触触低温前，使胞内水通过膜渗出，而不形成冰晶而伤害细胞。低温前，使胞内水通过膜渗出，而不形成冰晶而伤害细胞。美美国国ATCC先先将将菌菌液液降降到到0，再再1/min降降低低到到35，再放入液氮罐的气相中。，再放入液氮罐的气相中。因因液液氮氮蒸蒸发发导导致致温温度度上上升升，冰冰晶晶状状态态发发生生变变化化而而导导致致菌种死亡。所以要常常注意液氮残存量，定期补加。菌种死亡。所以要常常注意液氮残存量，定期补加。d 重新培养重新培养 将将安安瓿瓿管管从从冰冰箱箱中中取取出出，室室温温迅迅速速解解冻冻，升升温温至至0时即可打开安瓿管，移到适宜的斜面上培养。时即可打开安瓿管，移到适宜的

36、斜面上培养。三、三、国内外主要菌种保藏机构国内外主要菌种保藏机构国际机构：国际机构：ATCC American Type Culture Collection.Rockvill Maryland,U.S.A.美美国国标标准准菌菌种种收收藏藏所所，美美国国，马马里里兰兰州，罗克维尔市。州，罗克维尔市。CSH Cold Spring Harbor Laboratory.U.S.A.冷冷泉泉港港研研究究室，美国。室，美国。NIH National Institutes of Health.Bethesda,Maryland,U.S.A.国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达。国立卫生研究所，美国，

37、马里兰州，贝塞斯达。NRRL Northern Uti1ization Research and Development Division,U.S.Department of Argculture,Peoria,U.S.A.美美国国农农业业部部、北北方方开开发发利利用用研研究究部部，美美国国皮皮奥奥里里亚亚市。市。IAM Institute of Applied Micribiology.University of Tokyo,Japan.日日本本东东京京大大学学应应用用微微生生物物研研究究所所，日日本本东京。东京。IFO Instltute for Fermentation.Osaka,Ja

38、pan.发发酵酵研研究究所，日本大阪。所，日本大阪。KCC Kaken Chemical Company Ltd.Tokyo,Japan.科科研化学有限公司，日本东京。研化学有限公司，日本东京。NCTC National Collection of Type Culture.London,United Kingdom.国立标准菌种收藏所，英国伦敦。国立标准菌种收藏所，英国伦敦。国内机构：国内机构：中中国国微微生生物物菌菌种种保保藏藏管管理理委委员员会会(China Committee for Culture Collection of MicroorganismsCCCMS)。下设六个菌种保藏

39、管理中心。下设六个菌种保藏管理中心。1、普通微生物菌种保藏管理中心、普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)：中国科学院微生物研究所，北京中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌，细菌；：真菌，细菌；中国科学院武汉病毒研究所，武汉中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS-)：病毒。：病毒。2、农业微生物菌种保藏管理中心、农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)：中国农业科学院土壤肥料研究所，北京中国农业科学院土壤肥料研究所，北京(1SF)。3、工业微生物菌种保藏管理中心、工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)：轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京(IFFl)。4

40、、医学微生物菌种保藏管理中心、医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)：中国医学科学院皮肤病研究所，南京中国医学科学院皮肤病研究所，南京(1D)：真菌。：真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京卫生部药品生物制品检定所，北京(NICPBP)：细菌。：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。5、抗生素菌种保藏管理中心、抗生素菌种保藏管理中心(CACC)：中国医学科学院抗生素研究所，北京中国医学科学院抗生素研究所，北京(1A)。四川抗生素工业研究所，成都四川抗生素工业研究所，成都(STA)：新抗生素菌种。：新抗生素菌种。华华北北药药厂厂抗抗生生素素研研究究所所，石石家家庄庄(IANP)：生生产产用用抗抗生生素菌种。素菌种。6、兽医微生物菌种保藏管理中心、兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)：农业部兽医药品监察所，北京。农业部兽医药品监察所，北京。