（课标通用）山东省高考生物总复习 第34讲 基因工程（包括PCR技术）课件-人教版高三全册生物课件.pptx

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1、第第3434讲讲 基因工程（包括基因工程（包括PCRPCR技术）技术）考纲导学山东省生物课程实施指导意见要求核心素养解读命题趋势备考指南(1)简述基因工程的诞生。(2)简述基因工程的原理及技术(含PCR技术)(3)举例说出基因工程的应用(4)简述蛋白质工程(5)DNA的粗提取与鉴定(1)通过设计某种转基因生物的研制过程,简述基因工程的原理、工具和基本操作程序,从而认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新的观点。(2)运用逆向思维,通过基因修饰或基因合成对现有的蛋白质进行改造,或制造新的蛋白质,掌握蛋白质工程的原理。(3)以鸡血为实验材料进行探究实验,掌握DNA粗提取和鉴定的方法。题型内

2、容:基因工程的工具与操作步骤考查形式:多以最新基因工程研究成果为载体考查(1)表解比较法对比理解限制酶、DNA连接酶和载体的作用(2)实例分析法理解基因工程的原理与技术考点一 基因工程的操作工具考点二 基因工程的基本操作总总纲纲目目录录考点三 基因工程的应用和蛋白质工程真题再现 模拟预测考点四 PCR 技术和DNA 粗提取与鉴定1.基因工程的概念基因工程的概念(1)手段:按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性。(2)目的:创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。(3)水平:DNA分子水平。(4)原理:基因重组考点一基因工程的操作工具考点一

3、基因工程的操作工具2.基因工程的基本工具基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称:限制酶)来源:主要从原核生物中分离纯化而来。作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。结果:产生黏性末端或平末端。常用类型EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能连接黏性末端连接黏性末端或平末端结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键(2)DNA连接酶(3)载体条件:能自我复制、有一个至多个限制酶切割位点、有特殊的标记基因。常用载体质粒。其他载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒等。1.DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来()2.

4、EcoliDNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端()3.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因()4.每个重组质粒至少含一个限制酶识别位点()5.限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶()6.质粒是小型环状DNA分子,是基因工程常用的载体()7.载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中,使之稳定存在并表达()8.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制()下图中的图1和图2分别表示的是EcoR限制酶和Sma限制酶的作用示意图,据图分析下列问题:图1图2(1)图中EcoR限制酶识别的碱基序列是GAATTC,切割位点在G和A之间;Sma限制酶

5、识别的碱基序列是CCCGGG,切割位点在G和C之间。(2)以上实例说明限制酶具有专一性。1.限制酶和限制酶和DNA连接酶的关系连接酶的关系(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(3)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶,以获得相同的黏性末端,但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。(4)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”,可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体,使目的基因两侧及载体上各自具有两个不

6、同的黏性末端。2.DNA相关六种酶的比较相关六种酶的比较名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个或多个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸以单链DNA为模板,将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链,形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸 以单链DNA为模板,将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端考向一限制性核酸内切酶、DNA连接酶等酶的作用1.(2018北京理综,5,6分)用Xho和

7、Sal两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是(D)图1酶切位点图图2电泳结果示意图A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图2中酶切产物可用于构建重组DNAC.泳道中是用Sal处理得到的酶切产物D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA解析解析限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列,不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列,由电泳图可知XhoI和SalI两种酶分别切割时,识别的序列不同,A正确;同种限制酶切割出的DNA片段,具有相同的粘性末端,再用DNA连接酶进行连接,可以构成重组DNA,B正确;SalI将DNA片段切成4段,XhoI将DNA片段切成3段,

8、根据电泳结果可知泳道为SalI,泳道为XhoI,C正确;限制酶切割双链DNA,酶切后的DNA片段仍然是双链DNA,D错误。2.(2018四川乐山调研)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。图(a)图(b)根据基因工程的有关知识,回答下列问题:(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 Sau3A酶切后的产物连接,理由是两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组

9、子,如图(c)所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有甲和丙,不能表达的原因是甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录。图(c)(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有 EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。技能提炼技能提炼限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择Pst。不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随

10、意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保产生相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因;如果所选酶的切割位点不是一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。考向二考查载体的作用和特点分析3.(2017北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图

11、1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是(C)A.用限制性核酸内切酶EcoR和连接酶构建重组质粒B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上解析解析用限制性核酸内切酶EcoR处理目的基因和质粒,可以使目的基因两侧和质粒产生相同的黏性末端,再用连接酶把切口连起来就能构建成重组质粒,A正确;农杆菌转化法适用于双子叶植物或裸子植物,菊花属于双子叶植物,故可用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞,B正确;质粒中只有潮霉素抗性基因,被转化的

12、菊花细胞只对潮霉素具有抗性,在培养基中添加那霉素,不能筛选被转化的菊花细胞,C错误;检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体上,可采用DNA分子杂交技术,D正确。4.如图所示为pBR322质粒,其中ampr(氨苄青霉素抗性基因)和tetr(四环素抗性基因)为标记基因,ori为复制原点,其他均为限制酶及其识别位点,并且每种限制酶都只有一个。pBR322质粒是基因工程较常用的运载体。回答下列相关问题:(1)制备重组质粒,需要限制酶和DNA连接酶。如制备重组质粒时,使用Pvu切割该质粒,则检测目的基因是否导入受体细胞,需要在培养基中添加四环素。(2)该质粒中的BamH识别的核苷酸序列及切割位点为GGA

13、TCC,而Sau3A识别的核苷酸序列只有4个碱基。若BamH和Sau3A分别切割DNA所形成的DNA片段能拼接成一条DNA链,则Sau3A识别的核苷酸序列及切割位点为GATC。该拼接在一起的DNA片段,能否被BamH识别?不一定能。(3)与图示质粒相比,完整的重组质粒中还应有启动子、终止子和目的基因等三种特殊的DNA片段。将重组质粒导入动、植物细胞的方法分别为显微注射法,农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法,如受体细胞为大肠杆菌,则该菌经钙离子处理后,将具备将外界DNA吸入细胞的特性。归纳拓展归纳拓展全面理解基因工程中的载体(1)应具备的条件能在受体细菌中复制并稳定保存,可使目的基因稳定存在且

14、数量可扩大。具有一个至多个限制酶切点,可供外源DNA片段插入。具有标记基因,可供重组DNA的鉴定和选择。(2)与膜载体的区别基因工程中的载体是DNA分子,能将目的基因导入受体细胞内,并利用它在宿主细菌内对目的基因进行大量复制;膜载体是蛋白质,与膜的通透生有关。考点二基因工程的基本操作考点二基因工程的基本操作1.目的基因的获取目的基因的获取(1)目的基因:主要指编码蛋白质的基因,也可以是一些具调控作用的因子。(2)获取方法从基因文库中获取人工合成利用PCR技术扩增2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心(1)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并可以遗传给下一代;使

15、目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的构成:3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测和鉴定目的基因的检测和鉴定1.为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体()2.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达()3.检测目的基因是否成功表达可用抗原抗体杂交技术()4.应用DNA探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达()如图为抗虫棉的培育过程,据图回答下列问题:(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么?一般情况下,为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体?目的基因是Bt毒蛋白基因,载体是Ti质粒

16、。用同一种限制酶处理目的基因和载体,可以获得相同的黏性末端,便于构建基因表达载体。(2)该实例中,采用何种方法导入目的基因?为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上?采用的方法是农杆菌转化法。由于Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上,而目的基因又插入到了T-DNA上,所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。(3)该实例中,检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种?抗原抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。基因组文库与基因组文库与cDNA文库的比较文库的比较1.(2018山东潍坊模拟)抗菌肽对治疗癌症有一定作用,如图表示抗菌肽的合成过程。下列相关说法正确的是

17、(A)克隆目的基因导入毕赤酵母菌筛选菌种甲醇诱导抗菌肽表达分离纯化功能研究A.用PCR技术克隆目的基因不需要DNA解旋酶B.基因表达载体包含起始密码子和终止密码子C.用显微注射法导入基因表达载体D.筛选菌种时用基因探针检测相关蛋白质解析解析PCR技术中采用高温变性使DNA解旋,因此用PCR技术克隆目的基因不需要DNA解旋酶,A正确;基因表达载体包含启动子和终止子,而起始密码子和终止密码子在mRNA上,B错误;将基因表达载体导入酵母菌细胞时应用感受态细胞法,C错误;筛选菌种时用基因探针检测相关基因或mRNA,不能用基因探针检测蛋白质,D错误。2.(2018广东模拟)烟草易受烟草花叶病毒(TMV)

18、感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因,能抵抗TMV感染,研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV烟草,操作流程如下图所示。请回答下列问题:(1)过程所用RNA可以从绞股蓝细胞的细胞质基质中获取。(2)过程可以采用PCR(或多聚酶链式反应)技术获得大量目的基因,该技术的实质是双链DNA复制。(3)过程最常用的方法是农杆菌转化法,该方法中需将目的基因插入受体细胞的染色体DNA上。(4)过程所用到的培养基除了卡那霉素之外,还需要加入的特殊物质是植物激素(或生长素和细胞分裂素)。过程还需要进行基因工程操作步骤中的目的基因的检测与鉴定,在分子水平上检验获得的烟草能否抗TMV的方法是抗原抗体杂交。

19、3.某质粒上有Sal、Hind、BamH三种限制酶切割位点,同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图所示,请回答下列问题。(1)抗盐基因是否在烟草细胞中稳定遗传的关键是抗盐基因(目的基因)是否插入到烟草的染色体DNA上。(2)在构建重组质粒时,应选用Hind和 Sal两种酶对目的基因和质粒进行切割,以保证重组DNA序列的唯一性。(3)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法。含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖,农杆菌中是否已含有目的基因?否(是/否)。为什么?含有目的基因的质粒抗

20、四环素的基因被破坏。(4)愈伤组织经再分化形成完整植株,这一过程需要再转接到分化培养基上进行培养,该过程的实质是基因的选择性表达。考点三基因工程的应用和蛋白质工程考点三基因工程的应用和蛋白质工程1.基因工程的应用基因工程的应用(1)植物基因工程:培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物;利用转基因改良植物的品质。(2)动物基因工程:提高动物生长速度从而提高产品产量;用于改善畜产品品质;用转基因动物生产药物;用转基因动物作器官移植的供体等。(3)基因工程药物方式:利用基因工程培育“工程菌”来生产药品。成果:利用“工程菌”可生产细胞因子、抗体、疫苗、激素等。2.基因诊断与基因治疗基因诊断

21、与基因治疗原理操作过程进展基因治疗基因表达利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中,以表达出正常性状来治疗临床实验基因诊断碱基互补配对制作特定DNA探针与病人样品DNA混合分析杂交带情况临床应用3.蛋白质工程蛋白质工程(1)概念基础:蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系手段:基因修饰或基因合成目的:合成满足人类生产和生活需求的蛋白质(3)结果:改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。(4)应用:主要集中应用于对现有蛋白质进行改造,改良生物性状。(2)基本流程1.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌,获得能产生人干扰素的菌株()2.利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品,如人的血清白蛋白,这

22、是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中()3.由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用()4.蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质()5.蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作,定向改变分子的结构()考向一考查基因工程的应用1.(2018山东菏泽模拟)人类基因治疗报道,在美国佛罗里达大学基因治疗中心接受基因治疗的三名遗传性失明患者都重新获得了一定的视力,并且没有严重的副作用。基因治疗是指(A)A.把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中,达到治疗疾病的目的B.对有缺陷的细胞进行修复,从而使其恢复正常,达到治疗疾病的目的C.运用人工诱变方法,使有基因缺陷的细胞发生基因

23、突变,从而恢复正常D.运用基因工程技术,把有缺陷的基因切除,达到治疗疾病的目的解析解析基因治疗只是将正常的外源基因导入病人体内,使该基因的表达产物发挥功能,从而达到治疗疾病的目的,而细胞中的缺陷基因并未得到修复,基因治疗不是切除病变基因或诱发其突变。2.鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子,广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因,构建基因表达载体,通过农杆菌介导法导入烟草,以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程,表示相关的操作,两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题:(1)步骤中,利用PCR技术扩增干扰素

24、基因时,设计引物序列的主要依据是鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列。科研人员还在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列,以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化,构建表达载体需用两种限制酶,选择的原则是:Ti质粒内,每种限制酶有1个切割位点,酶切后,目的基因形成的两个黏性末端序列不相同(相同/不相同)(2)步骤所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有复制原点,步骤中需先用Ca2+处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。(3)步骤中,科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后,先通过逆转录获得DNA,再进行PCR扩增,若最终未能检测出干扰素基因,其可能原因是鸡干扰素基因未能导入烟草

25、愈伤组织细胞或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录或鸡干扰素的mRNA已经被水解。3.(2018河南中原质检)干旱会影响农作物产量,科学家们对此进行了研究。下图为用探针检验某一抗旱植物基因型的原理,相关基因用R和r表示。(1)在利用PCR技术扩增R或r基因的过程中,利用引物可寻找抗旱基因的位置并进行扩增。(2)若被检植株发生A现象,不发生B、C现象。据此推测检测另一抗旱植物时会发生A或B(填“A”“B”或“A或B”)现象。(3)用从基因文库中获取目的基因的方法获取抗旱基因时需要用到限制酶,限制酶能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二

26、酯键断开。(4)经检测,抗旱基因已经导入到烟草细胞,但未检测出抗旱基因转录出的mRNA,从构建基因表达载体的角度推测,最可能的原因是基因表达载体上目的基因首端未加入启动子。(5)要快速繁殖转基因抗旱烟草植株,目前常用的技术是植物组织培养,该技术的基本过程是:将离体的烟草细胞诱导脱分化形成愈伤组织,然后再分化出根和芽并发育成小植株。该技术在作物新品种的培育方面两个最主要的应用是:突变体的利用和单倍体育种。解析解析(2)被检植物发生A现象,不发生B、C现象,即r探针没有形成杂交环,所以被检植物的基因型为RR。因此另一抗旱植物的基因型为RR或Rr,据图分析可发生A或B现象。考向二考查蛋白质工程的概念

27、和过程4.(2018山东济宁模拟)某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶的结构和功能很相似,只是其热稳定性较差,进入人体后容易失效。现要将此酶开发成一种片剂,临床治疗食物消化不良,最佳方案是(A)A.替换此酶中的少数氨基酸,以改善其功能B.将此酶与人蛋白酶进行拼接,形成新的蛋白酶C.重新设计与创造一种蛋白酶D.减少此酶在片剂中的含量解析解析要想使某种微生物合成的蛋白酶热稳定性有所提高,就要改变蛋白质的结构,此类问题一般是对蛋白质中的个别氨基酸进行替换。5.(2018安徽马鞍山模拟)胰岛素可以用于治疗糖尿病,但是胰岛素被注射到人体后,会堆积在皮下,并要经过较长的时间才能进入血液中,而进入血

28、液的胰岛素又容易被分解,因此,治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程,请据图回答有关问题:(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键,图中构建新的胰岛素模型的主要依据是蛋白质的预期功能。(2)人工合成的DNA与载体结合后,被转移到大肠杆菌等受体细胞中才能得到准确表达。(3)若要利用大肠杆菌生产速效胰岛素,需用到的生物工程有蛋白质工程、基因工程和发酵工程。(4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是什么?根据新的胰岛素中氨基酸的序列,推测出其脱氧核苷酸序列,然后利用DNA合成仪来合成出新的胰岛素基因。解析解析(1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求

29、,对蛋白质结构进行分子设计,因此,图中构建新的胰岛素模型的依据是预期胰岛素,即速效胰岛素的功能。(2)人工合成的目的基因与载体结合后,被导入受体细胞中才能得以表达。(3)利用蛋白质工程生产自然界中原本不存在的蛋白质,需对原有的胰岛素进行改造,根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出其基因中的脱氧核苷酸序列,人工合成新的胰岛素基因,得到目的基因,改造好的目的基因需通过基因工程将其导入受体细胞获得工程菌,再利用工程菌进行发酵,从而获取大量产品,因此该过程涉及蛋白质工程、基因工程和发酵工程。(4)由新的蛋白质模型到构建新的基因,其基本设计思路是根据新的蛋白质中的氨基酸序列,推测出基因中的脱氧核苷酸序列,然

30、后用DNA合成仪直接合成出新的基因。项目蛋白质工程基因工程实质定向改造或生产人类所需蛋白质定向改造生物的遗传特性,以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)结果生产自然界中没有的蛋白质 生产自然界中已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程,因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质,需要通过基因修饰或基因合成实现,基因工程中所需酶也需要蛋白质工程进行修饰、改造以提高其功能归纳拓展归纳拓展蛋白质工程与基因工程的比较考点四考点四PCRPCR技术和技术和DNADNA粗提取与鉴定粗提取与鉴定1.PCR技术技术(1)PCR的含义:是一项在生物体外复制特定DNA片段的核

31、酸合成技术。(2)目的:短时间内大量扩增目的基因(3)原理:DNA双链复制(4)前提:有一段已知目的基因的核苷酸序列作为PCR模板;引物;热稳定DNA聚合酶(Tap酶);四种脱氧核苷酸。(5)过程与结果过程结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了2个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在DNA扩增仪中完成的。2.DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定(1)原理溶解度DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。DNA不溶于酒精。DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。鉴定:DNA+二苯胺试剂蓝色。(2)操作流程1.设计扩增目的基因的引物时不必考

32、虑表达载体的序列()2.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列()3.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶()4.用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质()5.提取DNA时,如果没有鸡血材料,可用猪血代替()6.在DNA的粗提取与鉴定实验中,将丝状物溶解在2mol/LNaCl溶液中,加入二苯胺试剂即呈蓝色()下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作,据图分析下列问题:(1)操作和都是加入蒸馏水,其目的一样吗?不一样。是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质;是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14mol/L,去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。(2)操作中加入

33、酒精的目的是什么?此时搅拌要注意什么?中加入酒精的目的是析出DNA,去除其中溶于酒精的杂质。这时候搅拌要沿一个方向,轻缓的进行。1.生物体内生物体内DNA复制与复制与PCR反应的区别反应的区别项目体内DNA复制PCR技术场所主要在细胞核内生物体外酶DNA聚合酶、解旋酶热稳定DNA聚合酶(Taq酶)条件模板、ATP、常温模板、ATP、引物链、温度变化(909555607075)原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸特点形成的是整个DNA分子,一个细胞周期只复制一次短时间内形成含有大量目的基因的DNA片段2.DNA和蛋白质在不同和蛋白质在不同NaCl溶液中溶解度的比较溶液中溶解度的比较项目2 mol/L

34、NaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液溶解规律DNA溶解析出蛋白质部分发生盐析沉淀溶解NaCl溶液浓度从2mol/L逐渐降低的过程中,溶解度逐渐增大3.DNA的粗提取与鉴定中的的粗提取与鉴定中的“2、3、4”加蒸馏水2次加到鸡血细胞液中,使血细胞吸水破裂加到含DNA的2mol/L的NaCl溶液中,使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14mol/L,使DNA析出用纱布过滤3次过滤血细胞破裂液,得到含细胞核物质的滤液滤取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)过滤溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液4次使用NaCl溶液加2mol/L的NaCl溶液,溶解提取的细胞核物质用0.

35、14mol/L的NaCl溶液使DNA析出用2mol/L的NaCl溶液,溶解滤取的DNA黏稠物用2mol/L的NaCl溶液,溶解丝状物用于鉴定DNA考向一考查PCR技术1.聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,PCR过程一般经历下述30多次循环:95下使模板DNA变性、解链55下复性(引物与DNA模板链结合)72下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是(C)A.变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键,也可利用解旋酶实现B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷

36、酸D.PCR与细胞内DNA复制相比所需酶的最适温度较高解析解析PCR技术是在生物体外进行DNA复制的技术,其原理与DNA复制的原理是相同的,但前提是必须要有一段已知的目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。2.PCR是多聚酶链式反应的缩写,利用PCR技术可对目的基因进行扩增。请根据下面PCR反应原理示意图回答有关问题:(1)PCR的原理是DNA双链复制。(2)PCR技术使DNA解链是通过高温加热实现的,DNA的这种解链现象在一定条件下是可逆的(填“可逆的”或“不可逆的”)。(3)DNA解链后冷却的目的是让引物与互补DNA链相结合。(4)当温度加热至7075时,是热稳定DNA聚合酶把单个

37、脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接到引物上。如此逐渐延伸形成互补链,进而使目的基因加倍。(5)通过重复循环过程,使目的基因以指数形式扩增。考向二考查DNA的粗提取与鉴定3.实验中对DNA进行鉴定时,做如下操作:溶液不变蓝色溶液逐渐变蓝色DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色(1)根据上图,完成表格空白处的实验内容。(2)对于B试管,完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化?溶液颜色基本不变。(3)在沸水浴中加热的目的是加快颜色反应速率,同时说明DNA对高温有较强的耐受性。(4)A试管在实验中的作用是对照。(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与加入试管中的DNA(丝状物)的多少有关。解析解析A、B两

38、试管形成对照,B试管中含DNA丝状物,A试管中不含,起对照作用,其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5min,这样可加快颜色反应的速率,观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。1.(2018课标全国,38,15分)回答下列问题:(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的转化方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白(或答噬菌体蛋

39、白)组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。真题再现真题再现 模拟预测模拟预测在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。解析解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞,且重组质粒在不同细胞中能正常表达,说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同,生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,常用Ca2+

40、处理大肠杆菌,使之处于感受态,即Ca2+参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌,故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏,可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。2.(2018课标全国,38,15分)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5末端,获得了L1-GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶

41、切位点的示意图如下,图中E1E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题:(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是E1和E4。使用这两种酶进行酶切是为了保证甲的完整,也是为了保证甲与载体正确连接。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。(3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定,在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核D

42、NA(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。解析解析(1)构建基因表达载体时,使用的限制酶不能破坏融合基因。选用产生不同黏性末端的两种限制酶,可以防止自身环化,并且保证融合基因和质粒正确连接。(2)在牛的皮肤细胞中观察到绿色荧光,说明L1基因已经表达,即在该皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。(3)培育转基因的克隆牛需将含目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中。(4)为检测克隆牛的不同组织细胞中是否含有融合基因,需提取不同组织细胞的核DNA作为PCR模板,用PCR方法进行鉴定。3.(2017课标全国,38,15分)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片

43、段组成,编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成,如图1所示。回答下列问题:(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙,若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCTCAGGAAGGA),则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙,原因是编码乙的DNA序列起始端无ATG,转录出的mRNA无起始密码子。(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中,在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等,还加入了序列甲作为模板,加入了dNTP作为合成DNA的原料。(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白,要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用,某同学做了如

44、下实验:将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组,其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙,另一组作为对照,培养并定期检测T淋巴细胞浓度,结果如图2。由图2可知:当细胞浓度达到a时,添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加,此时若要使T淋巴细胞继续增殖,可采用的方法是进行细胞传代培养。细胞培养过程中,培养箱中通常要维持一定的CO2浓度,CO2的作用是维持培养液的pH。仅根据图1、图2可知,上述甲、乙、丙三种蛋白中,若缺少C(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段,则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。解析解析本题主要考查基因工程技术和动物细胞培养技术的相关知识。(1)由题干中编码蛋

45、白乙的DNA序列可知,编码乙的DNA序列起始端无ATG,转录出的mRNA上没有起始密码子AUG。(2)PCR需要的条件包括引物、耐高温的DNA聚合酶、DNA模板、四种游离的脱氧核苷酸等。(3)动物细胞培养中,细胞具有贴壁生长以及接触抑制的特点,当细胞浓度达到a时,若要使T淋巴细胞继续增殖,需要在培养基中加入胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)处理贴壁生长的细胞并分瓶进行传代培养;动物细胞培养过程中,需要在培养箱中通入一定浓度的CO2,CO2的作用是维持培养液的pH。由图2可知,加入蛋白丙刺激T淋巴细胞增殖的效果明显比加入蛋白甲、乙时低;结合图1中蛋白丙与蛋白甲、乙的DNA序列可知,缺少C片段所编码的肽段,会明显降低蛋白刺激T淋巴细胞增殖的效果。