（浙江选考）高考生物一轮复习 第30讲 微生物的利用课件-人教版高三全册生物课件.pptx

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1、第第3030讲讲微生物的利用一、微生物的实验室培养一、微生物的实验室培养1.培养基培养基(1)概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)成分:一般都含有碳源、氮源、水和无机盐,还需要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。教材研读2.无菌技术无菌技术方法3.实验操作实验操作牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备:计算称量溶化调节pH灭菌倒平板。二、细菌的分离方法二、细菌的分离方法:划线分离法和涂布分离法划线分离法和涂布分离法1.划线分离法划线分离法(1)方法:用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线,使聚集的菌种分散到培养基的表面。经培养,可看

2、到在划线的末端出现不连续的单个菌落,表明菌已被分离。在无菌操作下将单菌落接种到斜面上,每个斜面的菌落就是一个细菌产生的后代。(2)应用:用于基因工程的大肠杆菌等工程菌,可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因(如抗氨苄青霉素基因),如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素,由于非工程菌和其他杂菌都没有抗性基因,所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。2.涂布分离法涂布分离法:先将培养的菌液稀释,通常稀释到10-710-5倍,然后取0.1mL稀释度不同的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可产生相互分开的菌

3、落。3.二者比较二者比较:划线分离法,方法简单;涂布分离法,单菌落更易分开,但操作复杂。三、大肠杆菌的培养和分离三、大肠杆菌的培养和分离1.大肠杆菌的特点大肠杆菌的特点:革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。2.细菌的繁殖细菌的繁殖:以分裂的方式繁殖,分裂速度很快。3.细菌的扩大培养细菌的扩大培养:用LB液体培养基,划线分离用LB固体平面培养基。4.大肠杆菌的分离操作技术大肠杆菌的分离操作技术最常用的方法是划线分离法,其操作步骤是:(1)培养基灭菌:将刚配制好的50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基分别装入两个250mL的三角瓶中,加上封口膜,用高压锅进行灭菌。(2)倒平板:在酒精灯火焰旁将

4、固体培养基分别倒在4个培养皿中,使培养基铺平皿底部,待凝,使之形成平面。(3)接种扩大培养:靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角瓶的液体培养基中,三角瓶在37,每分钟200转的摇床中振荡培养12h。(4)划线分离:将摇床上培养12h的菌液在固体培养基的平板上连续划线,然后将盖好的培养皿倒置,放在37恒温培养箱中进行培养,1224h后,可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落,表明菌已被分离。(5)菌种保存:在无菌操作下将单菌落用接种环取出,再用划线法接种在空白斜面上,在37下培养24h后,置于4冰箱中保存。四、分离以尿素为氮源的微生物四、分离以尿素为氮源的微生物1.实验原理:不同微生物利用氮源种类

5、不同。有一些细菌含有脲酶,通过降解尿素作为其生长的氮源。尿素在脲酶的降解下产生NH3,使培养基的pH由原来的中性变为碱性,于是培养基中的酚红由红黄色变成红色。2.实验步骤实验步骤:(1)制备培养基:在60左右时,将两个三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基,在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中,摇匀后平放至凝固。(2)制备细菌悬液:在无菌条件下,将土样1g加到有99mL无菌水的三角瓶中,振荡10min,即成10-2土壤稀释液,依此方法制备出10-3、10-4和10-5的土壤稀释液。(3)涂布法分离:取0.1mL稀释10-4和10-5的土壤稀释液,分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中,用

6、灼烧法灭菌的玻璃刮刀将菌液涂布到整个平面上。(4)培养和观察:在37恒温箱中培养2448h,观察菌落数。3.预测本实验的结果预测本实验的结果:LB全营养固体培养基上的菌落多而杂;尿素固体培养基上的菌落少而纯,一定时间内,菌落周围出现红色区域。用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种,更容易形成单菌落的是10-5土壤稀释液。1.下列有关划线分离法的操作错误的是(D)A.将接种环放在火焰上灼烧B.将已冷却的接种环伸入菌液中只蘸取一次C.蘸取菌液和划线要在火焰旁进行D.划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连解析解析划线前,接种环需放在酒精灯火焰上灼烧灭菌;待接种环冷却后伸入菌液中蘸取菌液一次;蘸

7、取菌液和划线过程都要防止空气中杂菌污染,要在酒精灯火焰旁进行;划线时不能将最后一区的划线与第一区的划线相连,否则无法分离得到单菌落。2.为探究适宜环境下,固定容积的培养液中酵母菌种群数量变化规律,研究者进行了相关实验。下列叙述错误的是(D)A.利用血细胞计数板计数时需要振荡均匀后取样B.生长旺盛期的培养液上层比下层酵母菌数量多C.涂布分离法计数可用接种等量无菌水组作对照D.涂布分离法统计的酵母菌数目会比实际值略大解析解析探究培养液中酵母菌种群数量变化规律实验中,利用血细胞计数板计数时需要振荡均匀后取样,A正确;酵母菌通过需氧呼吸大量繁殖,因此生长旺盛期的培养液上层比下层酵母菌数量多,B正确;涂

8、布分离法计数可用接种等量无菌水组作对照,C正确;由于酵母菌会相互重叠,因此涂布分离法统计的酵母菌数目会比实际值略小,D错误。3.下列有关微生物培养的叙述正确的是(D)A.通常使用液体培养基分离获得细菌单菌落B.若培养基需要调节pH,应该在灭菌后进行C.用显微镜直接计数固体培养基中微生物数量D.倒置平板可防止培养基被滴落的冷凝水污染解析解析常用固体或半固体培养基分离获得细菌单菌落,A错误;若培养基需要调节pH,应该在灭菌前进行,B错误;显微镜直接计数法是测定培养液中微生物数量的方法,固体培养基上用涂布分离法直接计数单个菌落数,C错误;平板倒置是为了避免冷凝的液体掉到培养基上,污染培养基,D正确。

9、4.分离以尿素为氮源的细菌和分离大肠杆菌都使用了LB培养基,其成分(C)A.前者含琼脂,后者不含琼脂和琼脂糖B.两者都含有琼脂C.前者含有琼脂糖,后者不含琼脂糖但含琼脂D.两者都不含琼脂和琼脂糖解析解析琼脂和琼脂糖都可作为凝固剂,用于制备固体培养基。但琼脂为混合物,含少量含氮化合物,琼脂加以纯化,去除含氮化合物就成为琼脂糖。由于琼脂为混合物,其中含一定量的含氮化合物,因此不能用于分离以尿素为氮源的细菌。琼脂糖为琼脂的纯化物,不含含氮化合物,可用于分离以尿素为氮源的细菌。5.现有一升水样,梯度稀释至10-3倍。各取0.1mL已稀释10-3倍的水样分别接种到三个培养基上培养,记录的菌落数分别为15

10、、16、17个,则每升原水样中菌株数为个。(D)A.160B.1.6103C.1.6107D.1.6108解析解析题中梯度稀释的倍数是10-3,三个培养基上菌落的平均数为(15+16+17)/3=16(个),则每毫升样品中菌株数为16/0.1103=1.6105(个),所以每升原水样中的菌株数为1.6105103=1.6108(个)。6.为了调查某学校附近河流的水质状况,该学校生物兴趣小组测定了河流水样中的细菌含量,并进行了细菌的分离等工作。回答下列问题:(1)如图,该小组采用的是分离水样中的细菌。操作时,接种环通过灭菌,在第二次及以后的操作时,总是从上一次的末端开始,这样做的目的是。(2)该

11、实验组将接种好的培养皿在恒温箱中培养时倒置,其目的是;在培养基上产生的单个菌落在生态学中可以被称为。(3)根据培养皿上菌落的平均数可以计算河水中该细菌的密度,但计算的数据要比实际活菌的数目少,原因是。除上述的活菌计数法外,也是测定微生物数量的常用方法。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀,一部分进行静置培养,另一部分进行振荡培养。结果发现:振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是:。答案答案(1)划线分离法灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落(2)防止形成的冷凝水滴落在培养基上产生杂菌污染种群(3)当两个或者多个细胞连在一起时平板上观察到的是一个菌落显微镜计数(4

12、)振荡培养能提高培养液的溶解氧的含量,同时可以使菌体与培养液充分接触,提高营养物质的利用率解析解析(1)从图中可明显看到三个划线区域,这说明该小组采用的是划线分离法分离水样中的细菌。接种环是金属制品,可用灼烧灭菌。在第二次及以后的操作时,总是从上一次的末端开始,这样做的目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(2)将接种好的培养皿在恒温箱中培养时倒置,其目的是防止形成的冷凝水滴落在培养基上产生杂菌污染。种群是生活在同一区域的同种生物全部个体的总和,因此在培养基上产生的单个菌落在生态学中可以被称为种群。(3)根据培养皿上菌落的平均数可以计算河水中该细菌的密度,但计算的数据要比实际活菌的数目少

13、,原因是当两个或者多个细菌连在一起时平板上观察到的是一个菌落。除上述的活菌计数法外,显微镜计数也是测定微生物数量的常用方法。(4)振荡培养能提高培养液的溶解氧的含量,同时可以使菌体与培养液充分接触,提高营养物质的利用率,所以振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。7.(1)用射线处理一些霉菌后,稀释并接种在以较低浓度果胶为的培养基中,可获得产果胶酶的高产菌株。通过观察比较培养基上可判断菌株是否属于同一种类。(2)在分离高产果胶酶菌种的实验操作中,对于获得纯化的果胶酶高产菌单菌落影响最大的是。A.实验所用的霉菌孢子来源于多个菌株B.涂布前涂布器未在酒精灯火焰上的灼烧灭菌C.已添加果胶的蔗糖豆芽

14、汁培养基作为选择培养基D.实验操作过程中未打开超净台的过滤风答案答案(1)唯一碳源菌落的形态特征(2)C解析解析用于筛选产果胶酶的高产菌株的选择培养基应以果胶为唯一碳源;可以根据菌落的形态特征来判断菌株是否属于同一种类;C项中碳源不是唯一的。一、无菌技术的知识归纳一、无菌技术的知识归纳1.灭菌目的灭菌目的:为了获得纯净的培养物,关键是防止外来杂菌的污染。考点突破2.无菌操作的条件无菌操作的条件(1)各种器皿必须是无菌的;(2)各种培养基必须是无菌的;(3)细菌转移操作的过程必须是无菌的。3.三种常用灭菌方法的比较三种常用灭菌方法的比较灭菌方法适用材料或用具灭菌条件灭菌时间灼烧灭菌接种环、接种针

15、或其他金属用具在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧直至烧红干热灭菌玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等干热灭菌箱内,160170加热12h高压蒸汽灭菌培养基等100kPa,1211530min二、大肠杆菌的培养与分离中应注意的问题二、大肠杆菌的培养与分离中应注意的问题1.划线分离操作中的有关问题划线分离操作中的有关问题(1)在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环,在划线操作结束后,仍然需要灼烧接种环。第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境或感染操作者(2)在灼烧接种环之后,要等其

16、冷却后再进行划线,以免接种环温度太高,杀死菌种。(3)在做第二次以及其后的划线操作时,要从上一次划线的末端开始划线。每次划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始划线,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.进行恒温培养时进行恒温培养时,要将培养皿倒置的原因要将培养皿倒置的原因如果正放培养皿,则皿盖上形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落,则菌落中的菌会随水扩散,菌落间相互影响,很难再分成单菌落,达不到分离的目的。因此恒温培养时,培养皿必须倒置。知能拓展知能拓展有关培养基的类型及选择问题划分标准培养基

17、种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂,如琼脂观察微生物的运动、分类鉴定固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)分类、鉴别用途选择培养基允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他微生物生长培养、分离出特定微生物,如培养酵母菌和霉菌,可在培养基中加入青霉素;培养金黄色葡萄球菌,可在培养基中加入高浓度食盐鉴别培养基根据微生物的代谢特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物,如用伊红美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有,菌落

18、呈深紫色,并带有金属光泽)三、分离以尿素为氮源的微生物实验剖析三、分离以尿素为氮源的微生物实验剖析1.土样的获得土样的获得:从有哺乳动物排泄物的地方取得。从有哺乳动物排泄物的地方取得。2.实验步骤实验步骤:知能拓展知能拓展(1)用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基。琼脂是未被纯化的混合物,内含一定量的含氮化合物,不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。(2)培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红),标志着存在脲酶水解尿素的作用,从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大,表明菌株利用尿素的能力越强。(3)与全营养培养基上的菌落数比较,尿素培养基上只有少数

19、菌落,这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极小部分。1.无菌技术的常用方法项目消毒灭菌条件使用较为温和的理化方法使用强烈的理化因素结果杀死物体表面或内部一部分微生物杀死物体内外所有的微生物适用范围实验操作的空间、操作者的衣着和手微生物的培养器皿、接种用具和培养基等常用方法煮沸消毒法(如100,56min),巴氏消毒法(80,15min),酒精、氯气、石炭酸等化学药剂消毒法灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等名师点拨名师点拨对培养基、培养皿、接种环等不同的实验用具、器材及实验操作者所用的消毒和灭菌的方法不同:接种工具如接种环等金属用具使用灼烧灭菌;能耐高温的、需保持干燥的物品,如吸管、培养

20、皿等玻璃器皿和金属用具等,用干热灭菌;培养基一般用高压蒸汽灭菌;牛奶用巴氏消毒法灭菌;实验者的双手用70%的酒精消毒;水源用氯气消毒。2.微生物接种的常用方法微生物接种的常用方法项目划线分离法涂布分离法原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,即菌落将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落特点方法简单单菌落更易分开,但操作复杂些目的在培养

21、基上形成由单个细胞繁殖而来的子细胞群体菌落3.微生物数量的统计方法微生物数量的统计方法常规的计数方法是涂布分离法和显微镜直接计数法。(1)涂布分离法该法的基本原理:将待测含菌样品经适当稀释,使其中的微生物充分分散成单个细胞,然后取一定量的稀释样品液,接种到平板上。经过一定时间培养后,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的单菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个活菌。最后统计菌落数,根据其稀释倍数和取样量,换算出单位样品中所含的活菌数。用涂布分离法计数时,一般选择菌落数在30300的平板计数,同时做一系列浓度梯度实验,探究合适的稀释度。对分解尿素的微生物计数时,一般制备成10-2、10-3、10-

22、4、10-5土壤稀释液。(2)显微镜直接计数法测定酵母细胞数或霉菌孢子数常采用在显微镜下直接进行计数的方法,该法是将酵母菌或霉菌孢子悬液,放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中,在显微镜下直接进行计数,是一种常用的微生物计数方法。典例典例12016浙江10月选考,32(一)请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题:(1)LB固体培养基:取适量的蛋白胨、酵母提取液、NaCl,加入一定量的蒸馏水溶解,再加,灭菌备用。(2)尿素固体培养基:先将适宜浓度的尿素溶液,用灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤,因为G6玻璃砂漏斗,故用于过滤除菌,然后将尿素溶液加到已经灭菌的含有酚红的培养基中,备用。

23、(3)取适量含产脲酶细菌的10-4、10-5两种土壤稀释液,分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上,培养48h,推测固体培养基上生长的菌落数最少的是(A.10-5稀释液+尿素固体培养基B.10-5稀释液+LB固体培养基C.10-4稀释液+尿素固体培养基D.10-4稀释液+LB固体培养基)。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现,其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生所致。(4)制备固定化脲酶时,用石英砂吸附脲酶,装柱。再用蒸馏水洗涤固定化酶柱,其作用是。解题关键解题关键培养基选择分解尿素的微生物的原理:培养基的氮源为尿素,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,以尿素作为氮源;缺乏脲酶的

24、微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁殖,而受到抑制,所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。方法:能合成脲酶的细菌才能分解尿素.配制以尿素为唯一氮源的培养基,能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。为检测尿素分解菌的存在与否,在以尿素为唯一氮源的选择培养基中加入酚红指示剂,如果存在尿素分解菌,则指示剂将变红色。解析解析(1)制备固体培养基需要加入琼脂。(2)培养基、实验用品灭菌一般采用高压蒸汽灭菌,G6玻璃砂漏斗孔径很小,细菌不能滤过,故可用于过滤除菌。(3)LB固体培养基营养较为全面,尿素固体培养基以尿素为唯一氮源,所以在10-5稀释液+尿素固体培养基上生长的菌落数最少,细菌产生

25、的脲酶催化尿素分解产生氨(或NH3),使pH升高,培养基中的酚红指示剂就会变红。(4)用蒸馏水洗涤固定化酶柱,其作用为除去游离的脲酶。答案答案(1)琼脂(2)高压蒸汽孔径很小,细菌不能滤过(3)A红色环带氨(或NH3)(4)除去游离的脲酶1-1某同学用新鲜的泡菜汁为实验材料分离纯化出乳酸菌,用来生产酸奶。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明,乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。(1)分离纯化乳酸菌时,首先需要用对泡菜汁进行梯度稀释,然后采用法进行分离,可获得乳酸菌的单菌落。(2)推测分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有和。分离纯化时应挑选出的菌落作为候选菌。(3)获得纯化的乳酸

26、菌后,可以利用纯牛奶作为原料制作酸奶,发酵常在(A.有氧+常温B.无氧+常温C.有氧+低温D.无氧+低温)条件下进行。如果使用的是加了某些抗生素的纯牛奶作原料制酸奶,很有可能会发酵成怪味“酸奶”,其原因可能是。答案答案(1)无菌水涂布分离(2)鉴别乳酸菌中和产生的乳酸(或酸)具有透明圈(3)B抗生素具有杀菌作用,会杀死乳酸菌,导致乳酸发酵不能顺利进行解析解析(1)分离纯化乳酸菌时,首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释,在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的细菌将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落,有利于纯化乳酸菌。(2)在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙,可以中和乳酸菌代谢过程

27、中产生的乳酸,乳酸菌落会产生溶钙圈,有利于乳酸菌的识别和分离。分离纯化时应挑选出在平板上有透明圈的菌落作为候选菌。(3)乳酸发酵是厌氧发酵,在常温下进行。抗生素具有杀菌作用,会杀死乳酸菌,导致乳酸发酵不能顺利进行。1-22018浙江11月选考,32(一),14分回答与微生物培养及应用有关的问题:(1)对培养基进行高压蒸汽灭菌时,灭菌时间应从时开始计时。对于不耐热的液体培养基,一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中,采用方式可较快地进行过滤灭菌。(2)与酿造果醋相比,利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋,需增加的过程。某醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成,其中甘露醇的主要作用是。(3)为筛选

28、胞外-淀粉酶分泌型菌种,一般从(A.果园树下B.肉类加工厂周围C.米酒厂周围D.枯树周围)获得土样,用无菌水稀释,涂布到含有淀粉的选择培养基上培养,一段时间后在培养基表面滴加碘液,可在菌落周围观察到透明的水解圈。若要筛选酶活性较高的菌种,需挑选若干个比值大的菌落,分别利用液体培养基振荡培养进行扩增。然后将培养液离心,取用于检测酶活性。答案答案(1)达到设定的温度或压力值抽滤(2)将淀粉分解成糖作为碳源(3)C水解圈直径与菌落直径上清液解析解析(1)对培养基进行高压蒸汽灭菌时,灭菌时间应从达到设定的温度或压力值时开始计时。对于不耐热的液体培养基,一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中,采用抽滤方式可较快

29、地进行过滤灭菌,例如尿素。(2)大米、高粱等原料中富含淀粉,醋化醋杆菌无法直接利用淀粉,应先将淀粉分解为糖。某醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成,其中蛋白胨为微生物提供氮源,酵母提取物和甘露醇为微生物提供碳源。(3)以淀粉原料生产酒时,淀粉需在淀粉酶的催化作用下水解为可以进行发酵的糖。因此,可从米酒厂周围获得土样,筛选胞外-淀粉酶分泌型菌种。淀粉遇碘液变蓝,淀粉在-淀粉酶的催化作用下水解生成糊精,糊精滴加碘液,不会变蓝。在培养基表面滴加碘液,由于菌种产生胞外-淀粉酶水解淀粉形成透明圈,透明圈越大,说明-淀粉酶的活性越高。因此,挑选透明水解圈直径与菌落直径比值大的菌落来筛选酶活性较高的菌种。然后利用液体培养基振荡培养进行扩增,再对培养液进行离心取上清液得到淀粉酶提取液,用于检测酶活性。