《体内药物分析》PPT课件.ppt

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1、第四章第四章第四章第四章 体内药物分析体内药物分析体内药物分析体内药物分析 方法的建立与验证方法的建立与验证方法的建立与验证方法的建立与验证4/30/20231F分析方法的设计依据分析方法的设计依据F分析方法建立的一般步骤分析方法建立的一般步骤F分析方法验证的内容与要求分析方法验证的内容与要求F体内药物分析应用示例体内药物分析应用示例本章内容提要本章内容提要第四章 分析方法的建立与验证4/30/20232第一节第一节 分析方法的设计依据分析方法的设计依据建立分析建立分析检测方法的主要依据方法的主要依据待待测药物的理化性物的理化性质及在生物体内的存在状况及在生物体内的存在状况分析分析测定的目的与

2、要求定的目的与要求生物生物样品的品的类型与型与预处理方法理方法实验室条件室条件第四章 分析方法的建立与验证4/30/20233一、一、待测药物的理化性质及体内存在状况待测药物的理化性质及体内存在状况准确准确测定定生物生物样品中的品中的药物或其特定代物或其特定代谢物物预处理理待待测物物从从结合物或合物或缀合物中合物中释放放选择样品品预处理方法理方法首先首先应考考虑待待测药物的物的理化性理化性质药物在生物体内的物在生物体内的存在状况存在状况药物在生物体内的物在生物体内的生物生物转化化(代代谢)途径途径第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据4/30/20234(一一)待待测药物的理化

3、性物的理化性质药物的物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等脂性、溶解度、分配系数等预处理及理及检测方法方法具有具有亲脂性脂性在适当的在适当的pH值下用下用溶溶剂萃取萃取具具有有强极极性性或或亲水水性性沉沉淀淀蛋蛋白白、固固相相萃萃取取、离离子子对萃萃取取或或衍衍生生化后萃取化后萃取等等具有具有挥发性性GC测定法定法具有具有光光谱或或电化学特性化学特性分析分析检测方法方法药物的物的稳定性定性萃取萃取浓缩技技术对酸碱不酸碱不稳定定避免使用避免使用强酸或酸或强碱性溶碱性溶剂对热不不稳定定避免高温蒸避免高温蒸发溶溶剂第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据4/30/20235(二二)待

4、待测药物的体内存在状物的体内存在状态与血与血浆蛋白蛋白结合的合的强弱及弱及结合率的高低合率的高低分离萃取方法分离萃取方法蛋白蛋白结合合较强不宜直接采用溶不宜直接采用溶剂萃取萃取体内体内浓度高低、代度高低、代谢过程及其代程及其代谢产物物分析分析检测技技术浓度度较低低（尤其有（尤其有代代谢产物物共存）共存）代代谢产物的干物的干扰与特定代与特定代谢产物的同物的同时测定定采用采用LC-MS、EIA等分析等分析检测技技术 第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据4/30/20236二、分析测定的目的与要求二、分析测定的目的与要求体内体内药物分析的目的物分析的目的影响影响分析方法分析方法的的

5、应用用药代代动力学力学研究研究药物在体内吸收、分布、代物在体内吸收、分布、代谢和排泄和排泄过程程血血浆浓度随度随时间的的变化化过程；代程；代谢途径及代途径及代谢产物物要求要求 同同时测定原形定原形药物和代物和代谢产物物检测 宽线性范性范围(CmaxCmax的的1/20)、高灵敏度高灵敏度(10-9g/ml)和高和高专属属 性性(分离能力分离能力)(原形原形药物及其代物及其代谢产物的分离物的分离)方法方法 不必不必强调方法的方法的简便、快速；便、快速；大多采用色大多采用色谱及其脱及其脱线或在或在线联用技用技术，如，如HPLC、LC-MS第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据4/3

6、0/20237二、分析测定的目的与要求二、分析测定的目的与要求临床治床治疗药物物监测 有效治有效治疗浓度范度范围内内药物物浓度度方法方法尽量尽量简便、易行；适用于便、易行；适用于长期、批量期、批量样品的品的测定定大多采用大多采用UV、RIA或或EIA等等中毒患者的中毒患者的临床床抢救救 药物物浓度极高度极高方法方法不必不必强调方法的灵敏度，方法的灵敏度，强调方法的方法的特异性特异性和和分析速度分析速度大多采用色大多采用色谱及其及其联用技用技术GC、GC-MS、RIA或或EIA第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据4/30/20238三、生物样品的类型与预处理方法三、生物样品的类

7、型与预处理方法生物生物样品的品的类型与型与预处理方法理方法决定决定分析方法分析方法的的应用用 以血以血浆或血清或血清为分析分析样品品采用采用蛋白沉淀蛋白沉淀-溶溶剂萃取萃取预处理技理技术分析分析样品品较为“干干净”，可用，可用HPLC检测用用RIA分析分析样品的品的预处理方法可理方法可较为粗放粗放经过简单的蛋白沉淀或不的蛋白沉淀或不经任何任何预处理理直接直接测定定第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据4/30/20239四、实验室条件四、实验室条件在在设计体体内内药物物分分析析方方法法时，还应充充分分考考虑到到实验室室现有有的的或或有有可可能能在在其其它它实验室室使使用用的的仪

8、器装器装备，合理，合理选择可行的分析方法。可行的分析方法。第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据4/30/202310第二节第二节 分析方法分析方法建立的一般步骤建立的一般步骤 一、分析方法的一、分析方法的一、分析方法的一、分析方法的选择选择二、分析方法的建立二、分析方法的建立二、分析方法的建立二、分析方法的建立(一一一一)检测检测条件的条件的条件的条件的筛选筛选(二二二二)分离条件的分离条件的分离条件的分离条件的筛选筛选第四章 分析方法的建立与验证4/30/202311一、分析方法的选择一、分析方法的选择体内体内药物分析方法的物分析方法的设计生物生物样品中的品中的药物物浓度度

9、决定分析方法的决定分析方法的首要因素首要因素生物生物样品中品中药物或其特定代物或其特定代谢产物的物的浓度低、度低、样品量少品量少难以通以通过增加取增加取样量量提高方法灵敏度提高方法灵敏度通通过选择适当的分析方法适当的分析方法适适应样品分析需求品分析需求体内体内药物分析中常用分析方法物分析中常用分析方法特点特点见表表4-14-1第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤4/30/202312二、分析方法的建立二、分析方法的建立分析方法建立之前分析方法建立之前查阅文文献献资料料充充分分了了解解药物物在在体体内内的的动力力学学过程程，使使所所拟定的分析方法定的分析方法避免受到代避免受到代

10、谢产物的干物的干扰适用于适用于实际生物生物样品品测定定第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤4/30/202313二、分析方法的建立二、分析方法的建立初步拟定分析方法后初步拟定分析方法后进行一系列试验工作进行一系列试验工作选择最佳分析条件最佳分析条件同同时验证分析方法的可行性验证分析方法的可行性确确认是否适用于是否适用于实际生物生物样品品F分析方法的分析方法的建立建立和和验证过程过程是不可截然划分的是不可截然划分的 为便于讨论而分别叙述为便于讨论而分别叙述F分析方法的建立步骤分析方法的建立步骤第一步：第一步：第一步：第一步：检测检测条件的条件的条件的条件的筛选筛选第二步：分离条

11、件的第二步：分离条件的第二步：分离条件的第二步：分离条件的筛选筛选第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤4/30/202314(一一)检测条件的条件的筛选标准物准物质 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 确定最佳分析确定最佳分析检测条件条件(如色谱条件)和检测灵敏度灵敏度HPLC 调整检测器器(类型、条件)色色谱柱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)流流动相相(组分及其配比)及其流速柱温柱温、进样量量、内内标物物质的浓度及其加入量等 使各物质具有足足够的的方法灵敏度方法灵敏度(LOQ)良好的良好的色色谱参数参数(n、R、T)适当的适当的保留保留时间(tR)第四章

12、 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤4/30/202315(二二)分离条件的分离条件的筛选在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：1空白溶空白溶剂试验 溶剂(方法特异性方法特异性)2空白生物基空白生物基质试验 endogenouscompounds(方法特异性方法特异性)3模模拟生物生物样品品试验 方法效能指方法效能指标4实际生物生物样品品测试 代谢产物(方法特异性方法特异性)第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤4/30/2023161空白溶空白溶剂试验待测药物的非生物基非生物基质溶液溶液（通常为水溶液）采用拟定的

13、分析方法定的分析方法进行行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）测定响响应信号信号（如HPLC峰面积或峰高）考察目考察目标方法的特异性特异性空白值应尽可能小，并能有效校正第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤4/30/202317色色谱分析法分析法 可通过改改变反反应条条件件、萃萃取取方方法法或或萃萃取取条条件件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），甚至检测器器类型型空白试剂信号应不干不干扰药物的物的测定定（如）本步本步骤主要考察主要考察需需经化化学学反反应的的预处理理过程程，若预处理过程仅为生物样品的

14、提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验 第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤4/30/2023182.空白生物基空白生物基质试验空白生物基空白生物基质 (blank biological matrix)如空白血空白血浆照“1.空白溶空白溶剂试验”项下方法操作考察目考察目标生物基质中内源性物内源性物质对测定的干定的干扰（方法特异性）在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信信号号窗窗”（信号附近的有限范围）内不应出现内源性物内源性物质信号信号第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤4/30/2023193.模模拟生物生物样品品试验模模拟生物生

15、物样品品(质量控制量控制,QC样品品)空白生物基质中加入待测药物照“1.空白溶空白溶剂试验”项下方法操作考察目考察目标方法的线性范性范围、精密度与准确度精密度与准确度、灵敏度灵敏度 药物的萃取回收率萃取回收率等各项技术指标同时进一一步步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性方法特异性第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤4/30/202320色色谱分析法分析法进一步考察待测药物(或内标物)与内源性物质(或其它药物)的分离情况分离情况色谱峰的 tR、n 和 T 是否与水溶液的一致一致 色谱峰是否为单一成分一成分 标准曲线的截距是否显著偏离

16、零点偏离零点等内源性物内源性物质是否是否对待待测药物或内物或内标物物质构成干构成干扰第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤4/30/2023214.实际生物生物样品的品的测试空白生物基质和模拟生物样品试验确定的分析方法及其条件不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定药物在体内可能与内源性物质结合(如血血浆蛋白蛋白结合物合物)或代谢生成数个代代谢产物物及其进一步的结合物合物(或缀合物)实际生物生物样品品确立分析方法后，确立分析方法后，尚需尚需进行行实际生物生物样品的品的测试考察目考察目标代代谢产物物对药物、内标物质的干干扰情况进一步验证方法的可行性方法的可行性第四章 分析方法的建

17、立与验证第二节 分析方法的建立步骤4/30/202322第三节第三节 分析方法分析方法验证的内容与要求验证的内容与要求用于实际生物样品分析之前验证(validation)分析方法的可行性可行性与与可靠性可靠性方法验证时应考虑影响分析方法所有可变因素(采样,样品制备,色谱分离,检测与数据评价等)使用的技技术指指标效能指效能指标使用的样品品通常采用模模拟生物生物样品品和用药后的实际生物生物样品品第四章 分析方法的建立与验证4/30/202323验证步步骤首先为分析方法分析方法的验证特异性、精密度与准确度、回收率特异性、精密度与准确度、回收率定量限与定量限与检测限、溶液限、溶液稳定性定性其次为生物基

18、生物基质中中待测药物稳定性定性的验证室温放置、冷室温放置、冷冻（或冷藏）、（或冷藏）、冻-融循融循环第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202324验证的效能指的效能指标与基本要求与基本要求1特异性特异性避免干避免干扰2标准曲准曲线与与线性范性范围覆盖所有覆盖所有浓度范度范围3准确度准确度与与实际状况相符状况相符4精密度精密度结果可重果可重现5定量限定量限达到峰达到峰浓度的度的1/101/206稳定性定性确保所有确保所有样品准确品准确测定定7提取回收率提取回收率确保准确度确保准确度第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202325一、方

19、法特异性一、方法特异性(专属性或属性或选择性性)方法的特异性方法的特异性(specificity)又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用系指当有内源性物系指当有内源性物质存在存在时，方法准确，方法准确测定待定待测物物质的能力的能力专属性表示所检测的信号信号(响应)系属于待待测药物所特有物所特有的选择性系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区区分分(分离分离)的能力的能力特异性特异性函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性同一性考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023261.

20、1.内源性物内源性物质的干的干扰比比较待待测药物或其活性代物或其活性代谢产物物检测信号信号对照品（或标准品）空白生物基质模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）如HPLC色谱峰的tR、n 和T 是否一致及与内源性物质色谱峰的R确确证内源性物内源性物质对分析方法有无分析方法有无干干扰第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023272.2.代代谢产物的干物的干扰比比较模模拟生物生物样品和用品和用药后的后的实际生物生物样品的品的检测信号信号与代谢产物(在实际样品中tR 随随时间延长而增加)的R如HPLC色谱峰的tR、n 和T 或改变色谱条件(色谱柱)再比较确确证其它代其

21、它代谢产物物对分析方法有无分析方法有无干干扰结构已知的特定活性代构已知的特定活性代谢物的物的测定定必要时通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性对于于结构未知的代构未知的代谢产物的物的测定定可采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023283.3.伍用伍用药物的干物的干扰TDM 时还要考要考虑患者可能同患者可能同时服用服用药物物(通常通常为数有限数有限)的干的干扰比比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号信号如HPLC色谱峰的tR、n 和T 是否一致确确证同时服用药物对分析方

22、法的干干扰情况情况第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023294.4.与参比方法的相关性与参比方法的相关性除上述方法外，有除上述方法外，有时还可使用可使用参比方法参比方法对照照参比方法参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法如在TDM中使用UV(或RIA)时,可以HPLC(或GC)为参比参比方法参比方法测定定结果果为横坐横坐标(X);拟定方法定方法结果果为纵坐坐标(Y)用最小二乘法计算回归方程YabX (坐标标度相等)相关系数相关系数(r)表示两种方法测得结果的一致性若若r 1，表表示示拟定定方方法法为非非线性性，如RIA中抗血清滴度选择不当第

23、四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023304.4.与参比方法的相关性与参比方法的相关性YabX截距截距(a)表示拟定方法受到恒定干恒定干扰的程度内源性物质(UV)斜斜率率(b)表示拟定方法受到比比例例干干扰的程度标记抗原不纯(RIA)与参比方法的相关性比与参比方法的相关性比较除显示分析方法的特异性外斜率斜率b表示两种方法表示两种方法测得得结果的一致性果的一致性若参比方法准确度良好若参比方法准确度良好若截距若截距a0,则拟定方法的定方法的准确度准确度(回收率回收率)为100b(%)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202331二、

24、二、标准曲准曲线与与线性范性范围标准曲准曲线（standard curve）calibration curve or working curve生物生物样品中所品中所测定定药物物浓度与响度与响应的的相关性相关性（比例的程度）（比例的程度）通常用回通常用回归分析方法所得的分析方法所得的回回归方程方程来来评价价除少数方法（免疫分析法）外，除少数方法（免疫分析法）外，标准曲准曲线通常通常为线性模式性模式回回归分析法分析法为最小二乘法最小二乘法（least squares）或或加加权最小二乘法最小二乘法（weighted least squares）线性范性范围（linear rang）标准曲准曲线的

25、的最高最高与与最低最低浓度的区度的区间模模拟生物生物样品的品的测定定结果果应达到达到试验要求的精密度和准确度要求的精密度和准确度第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202332二、二、标准曲准曲线与与线性范性范围(续)标准曲准曲线用用模模拟生物生物样品品建立建立线性范性范围(不包括不包括零点零点)应能能覆盖全部生物覆盖全部生物样品品中的中的药物物浓度度不能使用不能使用外推的方法外推的方法求算未知生物求算未知生物样品中的品中的药物物浓度度 建立建立标准曲准曲线所使用的模所使用的模拟生物生物样品品应使用与待使用与待测的含的含药生物生物样品品相同的生物基相同的生物基质制

26、制备第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202333标准曲准曲线的一般建立方法的一般建立方法 1.标准系列溶液准系列溶液(非生物基非生物基质溶液溶液)的的制制备溶溶剂水或甲醇水或甲醇（或其他适当溶（或其他适当溶剂）浓度度标准模准模拟生物生物样品中品中药物物浓度的度的 50倍以上倍以上 加入量加入量为生物生物样品品总体体积的的 2%以下以下 避免避免标准模准模拟生物生物样品与品与实际样品存在品存在较大差异大差异浓度度较低低应除去溶除去溶剂后再加入生物基后再加入生物基质 否否则,在在实际样品品测定定时应加入等体加入等体积的溶的溶剂并并涡旋混匀旋混匀 第四章 分析方法的

27、建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023342.2.标准系列溶液的准系列溶液的浓度范度范围至少含至少含58个个浓度点度点(不包括零点不包括零点,即空白即空白)可可覆盖全部待覆盖全部待测生物生物样品中的品中的药物物浓度度如：如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式等比梯度模式比例常数比例常数约为 2)设定最高定最高浓度度为100，最低，最低浓度度为1(个体差异个体差异)实际制制备时：500、250、100、50、20、10 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023353.3.标准系列模准系列模拟生物生物样品的制品的制备 空白生物基空

28、白生物基质(如血如血浆)加入加入标准系列溶液适量，准系列溶液适量，涡旋混匀旋混匀为防止在防止在标准溶液加入及准溶液加入及涡旋混合旋混合时造成的造成的损失失先加入先加入标准溶液准溶液 再加入空白生物基再加入空白生物基质 涡旋混匀旋混匀 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023364.4.标准曲准曲线的的绘制制以以待待测药物物的的检测响响应(如如色色谱峰峰面面积或或峰峰高高)或或与与内内标物物质的的检测响响应的比的比值(内内标法法)(因因变量量,y)对模模拟血血药浓度度(自自变量量,x)求得回求得回归方程方程(yabx)及其相关系数及其相关系数()在在一一组由由至

29、至少少7个个浓度度(不不包包括括零零点点)构构成成的的标准准曲曲线中中，至至多多可可有有2个个浓度点数据，可予剔除。度点数据，可予剔除。但但应有确切原因，如：有确切原因，如：样品品处理有理有损失、色失、色谱图有有问题，或，或显著著偏偏离离标准准曲曲线该数数据据参参与与标准准曲曲线回回归后后，计算算QC样品或返算品或返算该点点浓度度时显著偏离其著偏离其标称称浓度度(配制配制浓度度)其余其余应有至少有至少5个个浓度点在度点在标准曲准曲线上上第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023375.5.加加权最小二乘法最小二乘法最小二乘法最小二乘法每个每个浓度点度点绝对误差差

30、(yiyi)赋予同等的重要性予同等的重要性 标准曲准曲线上的高低上的高低浓度相差度相差悬殊殊(范范围达达102)低低浓度区的度区的计算算值相相对误差差过大，大，难以以满足足规定要求定要求加加权最小二乘法最小二乘法回回归计算算时增加一个增加一个权重因子重因子(w)各各浓度的响度的响应值与回与回归值的相的相对离差平方和达到最小离差平方和达到最小式中，式中，wi为标准曲准曲线上第上第i个个浓度点的度点的权重因子重因子第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023381）回）回归方程方程(y=a+b x)参数的参数的计算算 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证

31、与要求4/30/2023392）权重因子的重因子的选择加加权赋予低予低浓度点以更大的度点以更大的权重重在在实际工作中的一般方法工作中的一般方法当当wi=1/(yi)2时，则而而yi与与xi成正比成正比所以，令所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2(通常取通常取wi=1/C2)当当高高浓度点度点测量量值的准确度的准确度下降下降过大大低低浓度点度点权重重过大，大，降低降低低低浓度点的度点的权重重，wi=k/xi第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202340标准曲准曲线的的限度要求限度要求药代代动力学或生物利用度研究力学或生物利用度研究标准曲准曲线至少包括至少包括

32、5个个浓度度(通常通常为58个个浓度度,不包括零点不包括零点)最最高高浓度度应高高于于达达峰峰浓度度(Cmax)；最最低低浓度度应低低于于Cmax的的10%5%，并，并应为方法的方法的LOQ(非非LOD)回回归方程的截距方程的截距应接近于零接近于零相关系数要求相关系数要求 0.99(色色谱法法)或或0.98(生物学方法生物学方法)若若非非线性性，可可分分为高高低低两两个个浓度度区区间(每每个个区区间不不少少于于5个个浓度度)，分，分别加加权回回归如如1、2、5、10、20和和10、20、50、100、200第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202341三、准确度

33、三、准确度方法准确度方法准确度(accuracy)系系指指用用该方方法法测得得的的生生物物样品品中中待待测药物物的的浓度度与与其其真真实浓度的接近程度度的接近程度应使使用用实际生生物物样品品测定定，但但实际生生物物样品品的的浓度度是是未未知知的的所以，通常使用模所以，通常使用模拟生物生物样品品测定定一一般般用用相相对回回收收率率(relative recovery，RR)或或 相相对误差差(relative error，RE)表示表示第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023421.1.测定法定法取取空空白白生生物物基基质（如如血血浆）数数份份，照照标准准曲曲线

34、项下下方方法法操操作作，用用标准曲准曲线计算算在在标准曲准曲线范范围内制内制备质控控(quality control，QC)样品品高高(接近上限接近上限)、中、低、中、低(接近接近LOQ)3个个浓度度每一每一浓度至少度至少5个个样本本与随行的与随行的标准曲准曲线同法同法测定、定、计算，每个算，每个样品分析品分析测定定1次次 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023432.2.结果果计算与限度要求算与限度要求计算算测定定值M(measured)平平均均值与与理理论浓度度(加加入入值)A(added)比比值相相对回收率回收率相相对误差差限度要求限度要求相相对回收率

35、回收率应在在85%115%(LOQ附近附近80%120%)RE在在15%(LOQ附近附近为20%)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202344四、精密度四、精密度方法精密度方法精密度(precision)系指每次系指每次测定定结果与多次果与多次测定的平均定的平均值的的偏离程度偏离程度表示表示该分析方法的分析方法的可重复性可重复性(reproducibility)反映分析方法的反映分析方法的可操作可操作性，是方法性，是方法验证的基本要点之一的基本要点之一实际生物生物样品的量有限品的量有限(如血如血浆，一般，一般为0.52ml)使用模使用模拟生物生物样品品测定定

36、第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023451.1.表示方法表示方法方方法法精精密密度度一一般般用用标准准偏偏差差(standard deviation，SD)或或相相对标准偏差准偏差(relative standard deviation，RSD)表示表示 SD=RSD=包包 括括 批批 内内(within-run或或 intra-assay)RSD日日 内内(within-day)和和批批间(between-run或或inter-assay)RSD日日间(between-day，day-to-day)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求

37、4/30/2023462.2.测定法定法分分别测定法定法()照照准准确确度度项下下方方法法，取取空空白白生生物物基基质(如如血血浆)数数份份，分分别在在同同一一批内和不同批批内和不同批间制制备高、中、低高、中、低 3个个浓度的度的QC样品，并分析品，并分析测定定批内批内RSD每每一一浓度度56个个样品品，每每个个样品品测定定1次次，用用随随行行标准准曲曲线分分别计算算3个个浓度及每度及每1浓度的度的RSD批批间RSD每每1分分析析批批内内每每一一浓度度制制备1个个样品品，每每个个样品品测定定1次次；用用随行随行标准曲准曲线计算算3个个浓度度(每一每一浓度度56个分析批数据个分析批数据)的的RS

38、D第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023472.2.测定法定法连续测定法定法()()若若实际样品品测定定所所用用的的分分析析批批次次少少于于5批批，也也可可进行行3个个批批次次的的连续分析分析(每每1浓度的每度的每1批次批次为56个个样本本)方差分析法方差分析法 批批间RSD=批内批内RSD=第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023483.3.限度要求限度要求在在药代代动力学和生物利用度研究中力学和生物利用度研究中对 g/ml级水平的水平的RSD一般一般应10%ng/ml级水平的水平的RSD一般一般应15%在在LOQ附近附近

39、RSD应20%。第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202349五、定量限五、定量限方法定量限方法定量限(limit of quantitation，LOQ)系系指指在在保保证具具有有一一定定可可靠靠性性(准准确确度度与与精精密密度度符符合合要要求求)的的前前提下，能提下，能测定出生物定出生物样品中品中药物的最低物的最低浓度度又称又称为方法灵敏度方法灵敏度(sensitivity)标准曲准曲线上的最低上的最低浓度点度点(最低最低浓度点度点LOQ)要求要求 应能能满足足测定定35个消除半衰期后生物个消除半衰期后生物样品中的品中的药物物浓度度准确度在准确度在80%12

40、0%(或或RE在在20%的范的范围内内)RSD20%第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202350六、六、稳定性与定性与质量控制量控制稳定性定性包括方法包括方法稳定性和定性和样品品稳定性定性方法方法稳定性定性方法的耐用性方法的耐用性样品品稳定性定性生物生物样品的存放条件和品的存放条件和时间、冻-融循融循环测定法定法QC样品穿插于品穿插于实际样品品测定全定全过程程模模拟(或或实际)生物生物样品及其品及其预处理后的待理后的待测溶液溶液进行考察行考察要求要求 准确度准确度85%115%(RE在在15%范范围内内)，RSD15%第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方

41、法的验证与要求4/30/202351七、萃取回收率七、萃取回收率生物生物样品的品的预处理方法理方法重点考重点考虑方法准确度方法准确度(或或相相对回收率回收率)，操作，操作简便、快速便、快速萃取回收率萃取回收率(绝对回收率，回收率，absolute recovery)，70%萃取回收率与相萃取回收率与相对回收率的意回收率的意义不同不同萃取回收率萃取回收率考察生物考察生物样品品预处理理过程造成的程造成的药物的程度物的程度损失失相相对回收率回收率采用采用标准曲准曲线可准确可准确计算生物算生物样品中品中药物物浓度度第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023521 1.测

42、定法定法取取空空白白生生物物基基质(如如血血浆)，照照准准确确度度项下下方方法法，制制备高高、中中、低低3个个浓度的度的QC样品品(每一每一浓度至少度至少5个个样品品)，每个，每个样品分析品分析测定定1次次另另取取等等量量的的相相同同3个个浓度度的的标准准溶溶液液，用用溶溶解解模模拟生生物物样品品经提提取取处理后的残渣的溶理后的残渣的溶剂稀稀释至同体至同体积，同法，同法测定定AT经萃取后的萃取后的QC样品的品的检测信号或比信号或比值(内内标法法)AS未未经萃取的萃取的标准溶液的准溶液的检测信号或比信号或比值(内内标法法)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/2023

43、532 2.限度要求限度要求萃取回收率一般萃取回收率一般应50%高、中高、中浓度的度的RSD应15%低低浓度的度的RSD应20%。第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202354第四节第四节 体内药物分析方法体内药物分析方法应用示例应用示例第三代第三代喹诺酮类广广谱抗菌抗菌药盐酸酸环丙沙星片人体生物等效性丙沙星片人体生物等效性研究研究一、文献一、文献调研研性性质在在水水中中溶溶解解，在在甲甲醇醇中中微微溶溶，在在乙乙醇醇中中极极微微溶溶解解，在在氯仿仿中中几几乎乎不不溶溶，在在氢氧氧化化钠试液液中中易易溶溶；环丙丙沙沙星星游游离离体体在在水水中中不不溶溶，在乙醇、

44、二在乙醇、二氯甲甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。中极微溶解，在稀醋酸中溶解。第四章 分析方法的建立与验证4/30/202355药动学参数学参数吸收吸收过程程空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度约为49%70%Cmax 口服口服500mg后平均后平均Cmaxmg/LTmax 12h T1/2 血中血中T1/2约为4h，肾功能减退功能减退时稍有延稍有延长至至6h蛋白蛋白结合率合率20%40%代代谢 口服口服给药24h内，内，40%50%原形、原形、15%代代谢物物经肾排出排出第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202356体内分析方法体

45、内分析方法RP-HPLC色色谱柱柱ODS色色谱柱柱流流动相相甲甲醇醇(乙乙腈)-磷磷酸酸(枸枸橼酸酸)缓冲冲液液(三三乙乙胺胺调节pH2.33.5)，或，或离子离子对色色谱:溴化十六溴化十六烷基三甲基基三甲基铵(氢氧化四丁基氧化四丁基铵)检测紫外或紫外或荧光光检测生物生物样品品预处理理蛋白沉淀法蛋白沉淀法甲醇、乙甲醇、乙腈或高或高氯酸沉淀蛋白后直接酸沉淀蛋白后直接进样溶溶剂萃取法萃取法二二氯甲甲烷-异丙醇、异丙醇、氯仿仿-异丙醇混合溶异丙醇混合溶剂蛋白沉淀蛋白沉淀-溶溶剂萃取萃取乙乙腈沉淀蛋白后二沉淀蛋白后二氯甲甲烷-异丙醇提取异丙醇提取 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要

46、求4/30/202357二、分析方法二、分析方法设计1分析方法分析方法血血浆蛋白蛋白结合率低合率低(20%40%)、以原形从、以原形从肾排泄排泄生生物物等等效效性性研研究究测定定血血浆中中环丙丙沙沙星星原原形形药物物的的浓度度-时间曲曲线。初步初步拟定定：采用：采用RP-HPLC法法2检测方法方法紫紫外外灵灵敏敏度度1ng，ml，采采用用3倍倍量量乙乙腈沉沉淀淀蛋蛋白白，取取上上清清液液100 l进样，则要要求求血血浆中中环丙丙沙沙星星浓度度在在50ng/ml以以上上，当当Cmax在在2 g/ml以上以上(口服口服500mg)时基本可基本可满足足生物等效性研究要求生物等效性研究要求ng，能，能

47、满足足本本试验要求要求 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202358二、分析方法二、分析方法设计（续）3样品制品制备方法方法初初步步拟定定采采用用简便便、快快速速的的乙乙腈沉沉淀淀蛋蛋白白后后取取上上清清液液直直接接进样分析分析预试含含75%乙乙腈的的提提取取液液100 l进样后后，色色谱峰峰理理论板板数数、对称性下降称性下降(前沿峰前沿峰)，进而而导致致检测灵敏度降低灵敏度降低(峰高降低峰高降低)经进一步一步试验，确定确定为：ml乙乙腈1ml沉沉淀淀蛋蛋白白二二氯甲甲烷-异异丙丙醇醇(95:5)5ml萃萃取取 60氮氮气气流流吹干吹干流流动相相200 l溶解

48、溶解20 l进样灵敏度可达灵敏度可达2ng/ml(血血浆浓度度)，符合要求，符合要求(Cmax2 g/ml)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202359三、三、实验方案方案1给药方案方案20名受名受试者随机分者随机分为两两组，每，每组10人人第第1次次试验第第一一组口口服服受受试制制剂(相相当当于于环丙丙沙沙星星500mg)，第二，第二组口服相同口服相同剂量的参比制量的参比制剂第第2次次试验第第1次服次服药后第后第7天开始，两天开始，两组交交换给药第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202360三、三、实验方案（方案（续）2血血样

49、的采集与的采集与处理理分分别口口服服给药前前和和给药后后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax和和24.0(57个个t1/2)小小时由肘正中静脉取血由肘正中静脉取血 4 ml立立即即移移入入经肝肝素素处理理的的离离心心试管管中中，静静置置5分分钟后后，离离心心15分分钟(3000rpm)，分离血，分离血浆-20冰箱中保存待冰箱中保存待测第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202361三、三、实验方案（方案（续）3血血样分析法分析法色色谱条件条件高高效效液液相相色色谱仪(包包括括LC-10ATvp泵，RF-530荧光光检测器器)；色色谱柱柱为Kromasil O

50、DS-AP(200mm4.6 mm，5 m)mol/L磷酸溶液磷酸溶液(86:14)，ml/min检测波波长为 ex=277nm，em=445nm柱温柱温为40。第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求4/30/202362三、三、实验方案（方案（续）3血血样分析法分析法血血浆样品的品的预处理理ml，加加内内标溶溶液液(10 g/ml诺氟氟沙沙星星甲甲醇醇溶溶液液）50 l、ml，涡旋旋混混合合30s，离离心心5min，取取上上清清液液1ml，加加二二氯甲甲烷-异异丙丙醇醇(95:5)混混合合溶溶剂5ml，涡旋旋振振荡1min，离离心心5min，弃弃去去上上层水水相相，吸吸取取