分子生物学方法5159.pptx

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1、分子生物学研究方法分子生物学研究方法 1、重组、重组DNA技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件2、DNA操作技术操作技术3、基因克隆的主要载体系统、基因克隆的主要载体系统4、基因的分离与鉴定、基因的分离与鉴定v分子生物学从分子生物学从20世纪中叶开始高速发展，世纪中叶开始高速发展，最主要的原因之一是基因操作和基因工最主要的原因之一是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作：程技术的进步。基因操作：DNA的切割的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和成、定点突变和PCR扩增。

2、这是分子生扩增。这是分子生物学研究的核心技术。物学研究的核心技术。基因工程：基因工程：在体在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。表达。v跨越天然物种屏障、把来自任何生跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特工程技术区别于其他技术的根本特征。本章将在回顾重组征。本章将在回顾重组DNA技术史技术史上主要事件的基础上，讨论上主要事件的基础上，讨论DNA操操

3、作技术、基因克隆的常用载体系统作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等以及基因的分离与鉴定等3个环节。个环节。51 重组重组DNA技术史上的重大事件技术史上的重大事件v半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，主要有未有的进步，主要有3大成就大成就:第一，解决了第一，解决了遗传的物质基础问题遗传的物质基础问题基因的分子载体是基因的分子载体是DNA;第二，第二，DNA分子的双螺旋结构模型和分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了半保留复制机制，解决了基因的自我复制和基因的自我复制和世代交替问题世代交替问题;第三，第三，“中心法则中心法

4、则”和操纵和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗遗传信息的流动与表达机制。传信息的流动与表达机制。vDNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的技术的产生和发展。产生和发展。v重组重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特上最重要的事件。限制性核

5、酸内切酶能从特定碱基序列位点切开定碱基序列位点切开DNA。1972，Boyer实实验室发现核酸内切酶验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别能特异识别GAAUC序列，将序列，将DNA在这个位点切开产生在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。具有粘性末端的小片段。v他们还发现，他们还发现，EcoRl酶切产生的任何不酶切产生的任何不同来源的同来源的DNA片段能通过粘性末端之间片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此碱基互补作用而彼此“粘合粘合”起来。起来。v此后，大量类似于此后，大量类似于EroRl但具有独特识但具有独特识别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目前为止，科

6、学家已经几乎能随心所欲地前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何把任何DNA分子切割成一系列不连续的分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。研究。52 DNA操作技术操作技术v植物基因组DNA的提取：液氮对植物组织进行研磨破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。v材料 1三羟甲基氨基甲烷(Tris)2乙二胺四乙酸(EDTA)3氯化钠 4巯基乙

7、醇 5氯化钾 6异丙醇 7乙醇 8琼脂糖 9十二烷基硫酸钠(SDS)10EP管 11，陶瓷研钵 12加样枪和吸头 13氯仿 14酚v试剂1细胞提取液（100mmol/L TrisHCl=50/26.8 pH80）(100mL分装为10mL)，5mmoI/L EDTA，500mmol/L NaCl 1.25%SDS lmol/L 琉基乙醇 25mol/L KClv将细胞提取液、KCl溶液及容器灭菌。新鲜叶片，在液氮中研磨，分装在2只EP管中。加入740L细胞提取液，充分混匀。65水浴保温20min。从水浴中取出离心管，加入20L5mol/LKCl溶液，混匀，冰浴20min。8000r/min离心

8、10min。将上清液转移到另一EP管中。加等体积酚/氯仿混匀，2000r/min离心5min，取上清。加等体积氯仿，混匀，12000r/min，离心5min，取上清。加入061倍体积的异丙醇(沉淀DNA)，混匀。离心获得沉淀，70%乙醇洗3次。风干沉淀。521 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳v1基本原理基本原理 生物大分子在一定生物大分子在一定pH条件下，条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净

9、电荷数成正比，与分子的摩擦系数携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。v在生理条件下，核酸分子之糖在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，磷酸基团，呈离子化状态，DNA和和RNA多核多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中

10、，会向正电极的方向迁移。由于糖当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的酸分子本身的大小和构型大小和构型。这就是应用凝胶。这就是应用凝胶电泳技术分离电泳技术分离DNA片段的基本原理。片段的基本原理。第五章第五章 分子生物学研究方法分子生物学研究方法v2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳v琼脂

11、糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化，点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化，常用于常用于DNA片段的制备电泳。片段的制备电泳。v琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间之间;聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为11000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其

12、分辨能力就越强。例如，能力就越强。例如，20%的聚丙烯酰胺凝胶的聚丙烯酰胺凝胶可分离可分离1-6bp的的DNA小片段，而若要分离小片段，而若要分离1000bp的的DNA片段，就要用片段，就要用3%的聚丙烯酰的聚丙烯酰胺凝胶。再如，胺凝胶。再如，2%的琼脂糖凝胶可分离的琼脂糖凝胶可分离300bp的双链的双链DNA分子，而分离大片段分子，而分离大片段DNA就要用低浓度就要用低浓度(0.3%1.0%)的琼脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。v在凝胶电泳中，加入适量嗅化乙锭在凝胶电泳中，加入适量嗅化乙锭(ethidium bromide，简称，简称EB)染料对核酸分子进行染色，染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标

13、本放置在紫外光下观察，检测然后将电泳标本放置在紫外光下观察，检测灵敏快捷，灵敏快捷，DNA带中含带中含0.05g的微量的微量DNA，可以清晰地检测出来。可以清晰地检测出来。EB能插入到能插入到DNA或或RNA分子的相邻碱基之间分子的相邻碱基之间(图图5-4)，并在，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把波长的紫外光照射下发出荧光。把EB直接加到凝胶介质中，染料便会与直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA分子分子结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有DNA分子能吸收分子能吸收EB并发出荧光。在适当的染并发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与色条件下，荧光强

14、度与DNA片段的数量成正片段的数量成正比。比。5.2.2 核酸的分子杂交核酸的分子杂交v将特定的单链将特定的单链DNA或或RNA混合在一起，其相应的同混合在一起，其相应的同源区段（互补）就会退火形成双链结构。如果退火源区段（互补）就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的就被称为杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密切；反之，分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此，其亲缘关系则比较疏远。因此，DNA/DNA的杂

15、交的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成着亲缘关系，而形成DNA/RNA间杂种分子的能力间杂种分子的能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。v在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的离的DNA或或RNA分子，都必须通过毛细管或分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地胶中的位置原封不动地吸印吸印上去的，因此，上去的，因此，核酸杂交也被称为核酸杂交也被称为DN

16、A印迹杂交印迹杂交。由于该方。由于该方法是法是EMSouthern于于1975年首先设计出来年首先设计出来的，所以又叫做的，所以又叫做Southern blotting。杂交中。杂交中常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜和常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜和二乙氨基乙基纤维素滤膜二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。等。v核酸分子杂交包括两个步骤：第一，将样品核酸分子杂交包括两个步骤：第一，将样品转移到滤膜（印迹转移）转移到滤膜（印迹转移）;第二，将滤膜与第二，将滤膜与DNA或或RNA探针进行杂交。具体步骤：探针进行杂交。具体步骤：1、转移。转移。2、在、在80下烘烤下烘烤12h或用紫外线交

17、或用紫外线交联法将联法将DNA片段永久性地固定在滤膜上。片段永久性地固定在滤膜上。3、放入探针溶液中进行核酸杂交。一旦与滤膜放入探针溶液中进行核酸杂交。一旦与滤膜上的单链上的单链DNA杂交之后，就很难再解链。杂交之后，就很难再解链。4、用漂洗法去掉没有杂交上的探针分子。放射用漂洗法去掉没有杂交上的探针分子。放射性同位素标记的探针可检测性同位素标记的探针可检测2ng；为了安全，；为了安全，我们用我们用DIG（地高辛）标记探针，荧光法检（地高辛）标记探针，荧光法检测杂交信号测杂交信号。v基因组基因组DNA被限制性内切酶酶切为被限制性内切酶酶切为DNA片段；片段；各片段经电泳后在凝胶分为条带；（各片

18、段经电泳后在凝胶分为条带；（c）中由）中由下到上是：玻璃板、一层滤纸、凝胶、滤膜、下到上是：玻璃板、一层滤纸、凝胶、滤膜、很多层滤纸、玻璃板、重物。通过毛细管作很多层滤纸、玻璃板、重物。通过毛细管作用将凝胶上的用将凝胶上的DNA条带原封不动地条带原封不动地吸印吸印到到滤膜上去。（滤膜上去。（d）在）在80下烘烤下烘烤12h或用紫或用紫外线交联法将外线交联法将DNA片段永久性地固定在滤膜片段永久性地固定在滤膜上并形成单链。上并形成单链。(e)滤膜放入带标记的滤膜放入带标记的DNA或或RNA核酸探针溶液中进行核酸杂交。核酸探针溶液中进行核酸杂交。523 细菌转化细菌转化v 细菌转化是指一种细菌菌株

19、由于捕获了外源细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。导致性状特征发生遗传改变的生命过程。v大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，也是基大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，也是基因工程重要的实验菌株。将快速生长中的大肠杆菌因工程重要的实验菌株。将快速生长中的大肠杆菌置于经低温置于经低温(0)预处理的低渗氯化钙溶液中，便会预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀造成细胞膨胀(形成原生质球形成原生质球)，并与转化混合物中，并与转化混合物中的外源的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。立即将形成粘附在细胞表面的复合物。立即将该体系转移到该体系转移到42

20、下做短暂的热刺激，复合物便会下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。发生了遗传改变的菌株带着变异而被细胞所吸收。发生了遗传改变的菌株带着变异而遗传。遗传。524 核苷酸序列分析核苷酸序列分析v仪器分析发展很快。仪器分析发展很快。v如果将来做测序工作，有了分子生如果将来做测序工作，有了分子生物学基础，就可以做。物学基础，就可以做。v如果将来工作中需要测序，一般送如果将来工作中需要测序，一般送到公司去测。到公司去测。525 基因扩增基因扩增v 聚合酶链式反应，即聚合酶链式反应，即PCR技术，是技术，是一种在体外快速扩增特定基因或一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中序列的方

21、法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。片段扩增数十万乃至千百万倍。PCR技术的原理技术的原理v首先将双链首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链热分离成两条单链DNA分子，分子，DNA聚合酶以聚合酶以单链单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。因互补链。因为为DNA聚合酶需要有一小段双链聚合酶需要有一小段双链DNA来启动来启动(引导引导

22、)新链的合成，所以，新合成的新链的合成，所以，新合成的DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。链两端的退火决定的。PCR反应的全过程反应的全过程vDNA解链解链(变性变性)、引物、引物与模板与模板DNA相结合相结合(退退火火)、DNA合成合成(延伸延伸)三步，被不断重复。多三步，被不断重复。多次循环之后，反应混合次循环之后，反应混合物中所含有的双链物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之数，即两条引物位点之间的间的DNA区段的拷贝数，区段的拷贝数，理论上的最高值是理论上的最高值是2n。v具体说

23、：首先将含有待扩增具体说：首先将含有待扩增DNA样品的反应混样品的反应混合物放置在高温合物放置在高温(约约94)环境下加热环境下加热1min，使，使双链双链DNA变性，形成单链模板变性，形成单链模板DNA；然后降低；然后降低反应温度反应温度(约约56)制冷制冷1min，使引物与两条单，使引物与两条单链模板链模板DNA发生退火作用并结合在靶发生退火作用并结合在靶DNA区段区段两端的互补序列位置上；最后，两端的互补序列位置上；最后，72左右保温左右保温1至数分钟，在至数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模

24、板按5 3方向延伸，合成新生方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在互补链。以上循环在同一个同一个PCR管中进行。反应物加完后，温度由管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成后可以拿到产物。仪调整，程序完成后可以拿到产物。53 基因克隆的主要载体系统基因克隆的主要载体系统531 质粒质粒DNA及其分离纯化及其分离纯化v细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成分，质粒都是由色体并能自主复制的遗传成分，质粒都是由环形双链环形双链DNA组成的复制子（有少量线性质组成的复制子（有少量线性质粒、粒、RNA质粒报道）。质粒质粒报道）

25、。质粒DNA分子可以持分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可能续稳定地处于染色体外的游离状态，也可能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。分裂传递到后代。v质粒用作基因克隆的载体分子，获得大量纯质粒用作基因克隆的载体分子，获得大量纯化的质粒化的质粒DNA分子很重要。分子很重要。v寄主细胞的裂解是分离质粒寄主细胞的裂解是分离质粒DNA的关键步骤，的关键步骤，加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠(SDS)来促使大来促使大肠杆菌细胞裂解。细胞裂解反

26、应需要相当温肠杆菌细胞裂解。细胞裂解反应需要相当温和，同时实验操作又十分谨慎仔细，这样，和，同时实验操作又十分谨慎仔细，这样，绝大部分的染色体绝大部分的染色体DNA分子都将以高分子量分子都将以高分子量的形式释放出来，可以用高速离心的方法使的形式释放出来，可以用高速离心的方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到高纯度之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到高纯度的质粒的质粒DNA。5311氯化铅密度梯度离心法氯化铅密度梯度离心法v质粒质粒DNA一般仅占细胞总一般仅占细胞总DNA的的l%2%左左右，而且其化学结构与寄主染色体右，而且其化学结构与寄主染色体DNA之间之间并没有什么差别，所以，质粒并没有什么差别

27、，所以，质粒DNA的纯化须的纯化须从两者高级结构上的差异寻找依据。在细胞从两者高级结构上的差异寻找依据。在细胞裂解及裂解及DNA分离的过程中，大分子质量的细分离的过程中，大分子质量的细菌染色体菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结则由于其分子量较小、结构紧密，大部分仍能保持完整的环状结构。构紧密，大部分仍能保持完整的环状结构。v方法：将含有溴化乙锭方法：将含有溴化乙锭(EtBr)的氯化铯的氯化铯(CsCl)溶液加到大肠杆菌裂解液中，溶液加到大肠杆菌裂解液中，EtBr分分子便会通过嵌入作用而结合到子便会通过嵌入作用而

28、结合到DNA链上，导链上，导致双螺旋结构发生解旋反应。大肠杆菌染色致双螺旋结构发生解旋反应。大肠杆菌染色体体DNA片段具有游离的末端而易于解旋，会片段具有游离的末端而易于解旋，会结合大量的结合大量的EtBr分子。共价闭合环状的分子。共价闭合环状的DNA分子质粒，只能发生有限的解旋反应，限制分子质粒，只能发生有限的解旋反应，限制了了EtBr分子的结合数量，染色体分子的结合数量，染色体DNA片段比片段比质粒质粒DNA结合更多的结合更多的EtBr分子。分子。v在在DNA-EtBr复合物中，结合的复合物中，结合的EtBr分分子数量越多，其密度也就越低。因此，子数量越多，其密度也就越低。因此，在在EtB

29、r达到饱和浓度的条件下，质粒达到饱和浓度的条件下，质粒DNA就要比线性的染色体就要比线性的染色体DNA片段具有片段具有更高的密度。通过氯化铯密度梯度离心更高的密度。通过氯化铯密度梯度离心之后，它们就会被平衡在不同的位置，之后，它们就会被平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒从而达到纯化质粒DNA的目的。的目的。5312 碱变性法碱变性法v在在pH值介于值介于12.012.5的条件下加热的条件下加热DNA溶溶液，线性液，线性DNA会被变性，而闭合环状质粒会被变性，而闭合环状质粒DNA则不会被变性，尽管在这样的条件下连则不会被变性，尽管在这样的条件下连接接DNA互补链之间的氢键也会断开，但由于互补链之

30、间的氢键也会断开，但由于闭合环状质粒闭合环状质粒DNA的双螺旋主链骨架的彼此的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。在一起。v与此相反，线性与此相反，线性DNA的两条链则会完全分开。的两条链则会完全分开。若用制冷或恢复中性的方法处理若用制冷或恢复中性的方法处理DNA混合物，混合物，质粒质粒DNA能迅速而准确地复性，但随机断裂能迅速而准确地复性，但随机断裂产生的线性染色体产生的线性染色体DNA分子，彼此已经分离分子，彼此已经分离的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确，往往聚集形成网状结构，

31、与变性的蛋准确，往往聚集形成网状结构，与变性的蛋白质及白质及RNA一道被离心沉淀下来。可以用酒一道被离心沉淀下来。可以用酒精沉淀法收集仍然滞留在上清液中的质粒精沉淀法收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。v碱变性法是目前最流行的分离纯化质粒碱变性法是目前最流行的分离纯化质粒DNA的方法是碱变性法。的方法是碱变性法。532 重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体5321pSC101质粒载体质粒载体vpSC101是低拷贝数的大肠是低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有主细胞仅有12个拷贝。个拷贝。其分子大小为其分子大小为9.09 kb，编，编码有一个四环素抗性

32、基因码有一个四环素抗性基因(tetr)。该质粒具有。该质粒具有EcoRI、Hin d、Bam H I、Sal I、Xho I、Pvu 以及以及Sma I等等7种限制性核酸内切酶的种限制性核酸内切酶的单切割位点，在单切割位点，在Hin d、Bam H I和和 Sal I 等等3个位点个位点克隆外源克隆外源DNA，都会导致，都会导致tetr基因失活。基因失活。vpSClO1质粒具有可插人外源质粒具有可插人外源DNA的多的多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，还个限制性核酸内切酶的单克隆位点，还具有四环素抗性的强选择记号，便于筛具有四环素抗性的强选择记号，便于筛选。因此，它第一个被选为真核基因的选。因此

33、，它第一个被选为真核基因的克隆载体。这个质粒载体有其明显的缺克隆载体。这个质粒载体有其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSClOl DNA，其产量就要比其他质粒，其产量就要比其他质粒载体低得多。载体低得多。5322 pBR322质粒载体质粒载体v为改进转化子筛选技术，有必要用人工的方为改进转化子筛选技术，有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗药性的强选择记号，法构建一种既带有多种抗药性的强选择记号，又具有低分子质量、高拷贝以及外源又具有低分子质量、高拷贝以及外源DNA插插入不影响复制

34、功能的多种限制性核酸内切酶入不影响复制功能的多种限制性核酸内切酶单切割位点等优点的新的质粒载体。目前，单切割位点等优点的新的质粒载体。目前，在基因克隆中广泛使用的在基因克隆中广泛使用的pBR322质粒，就是质粒，就是按这种设想构建的一种大肠杆菌质粒载体。按这种设想构建的一种大肠杆菌质粒载体。vpBR322质粒是由质粒是由3个不同来源的部分组成的个不同来源的部分组成的:含有氨卡青霉素抗性基因（含有氨卡青霉素抗性基因（ampr)、四环素、四环素抗性基因抗性基因(tetr)和和DNA复制起点复制起点(ori)(图图5-22)。v pBR322质粒载体较小质粒载体较小,其长度为其长度为4363bp。不

35、仅易于纯化，而且即使携带上一段较大不仅易于纯化，而且即使携带上一段较大（6-8kb）的外源）的外源DNA片段，操作起来仍较片段，操作起来仍较为便利。为便利。vpBR322质粒载体具有两种抗生素抗性基因质粒载体具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号，方便选择。例如，以用作转化子的选择记号，方便选择。例如，将外源将外源DNA克隆在克隆在Bam H I位点上，将这样位点上，将这样的重组质粒转化到野生型大肠杆菌细胞中，的重组质粒转化到野生型大肠杆菌细胞中，并涂布在含有氨卡青霉素的选择性培养基平并涂布在含有氨卡青霉素的选择性培养基平板上，那么存活下来的菌落都将具有板上，那么存活下来的菌落都将具有A

36、mpr的的表型，它们也必定是获得了编码有这种抗性表型，它们也必定是获得了编码有这种抗性基因的转化子。第三个优点是具较高的拷贝基因的转化子。第三个优点是具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积10003000个拷贝，为重组体个拷贝，为重组体DNA的制备提的制备提供了极大的方便。供了极大的方便。533 噬菌体载体噬菌体载体v噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫作噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫作bacteriophage，来源于希腊文，来源于希腊文“phagos”，系指，系指吞噬之意。如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于吞噬之意。如同质粒分子一样，

37、噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的克隆和扩增特定的DNA片段，是一种良好的基因克片段，是一种良好的基因克隆载体。作为细菌寄生物的噬菌体，它可以在脱离隆载体。作为细菌寄生物的噬菌体，它可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制，这是因为大寄主细胞，就既不能生长也不能复制，这是因为大多数的噬菌体只能利用寄主核糖体、合成蛋白质的多数的噬菌体只能利用寄主核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。v噬菌体有两种类型：噬菌体有两种类型：v1、溶菌周期（

38、烈性噬菌体）：噬菌体、溶菌周期（烈性噬菌体）：噬菌体将其感染的寄主细胞转变成为噬菌体的将其感染的寄主细胞转变成为噬菌体的“制造厂制造厂”，产生出大量的子代噬菌体，产生出大量的子代噬菌体颗粒。颗粒。v2、溶源生长周期（温和噬菌体）：在、溶源生长周期（温和噬菌体）：在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体噬菌体DNA被整合到寄主细胞染色体被整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。上，成为它的一个组成部分。v以噬菌体以噬菌体DNA分子作载体，克隆含有目分子作载体，克隆含有目的基因的外源的基因的外源DNA片段，只要不导致重片段，只要不导致重要的噬菌体

39、基因失活，这种重组的噬菌要的噬菌体基因失活，这种重组的噬菌体体DNA感染了寄主细胞之后，插入的外感染了寄主细胞之后，插入的外源源DNA片段便会随着噬菌体片段便会随着噬菌体DNA分子一分子一道增殖。可按照类似于制备质粒道增殖。可按照类似于制备质粒DNA的的方法，分离到大量的重组体噬菌体方法，分离到大量的重组体噬菌体DNA，实现克隆基因的扩增。，实现克隆基因的扩增。v噬菌体的分子为噬菌体的分子为48.5kb，是一种中等，是一种中等大小的温和噬菌体。迄今已经定位的大小的温和噬菌体。迄今已经定位的噬菌体基因至少有噬菌体基因至少有61个，其中有一半左个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的调控（必需右参

40、与了噬菌体生命周期的调控（必需基因）基因）;另一部分基因则被称为非必需基另一部分基因则被称为非必需基因；当它们被外源基因取代之后，不影因；当它们被外源基因取代之后，不影响噬菌体的生命周期。由外源基因取代响噬菌体的生命周期。由外源基因取代非必需基因所形成的重组噬菌体非必需基因所形成的重组噬菌体DNA，可以随寄主细胞一起被复制和增殖。可以随寄主细胞一起被复制和增殖。v在在噬菌体线性双链噬菌体线性双链DNA分子的两端，各有一条由分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完个核苷酸组成的彼此完全互补的全互补的5单链突出序列单链突出序列（粘性末端）。当（粘性末端）。当噬菌噬菌体的线性体的线性DNA分子

41、注入到分子注入到被感染寄主细胞内时，会被感染寄主细胞内时，会通过粘性末端之间的互补通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链作用，形成环形双链DNA分子。随后在分子。随后在DNA连接酶连接酶的作用下，将相邻的的作用下，将相邻的5-P和和3-OH基团封闭起来。基团封闭起来。这种粘性末端结合形成的这种粘性末端结合形成的双链区段称为双链区段称为cos位点位点cohesive-end site，粘性，粘性末端位点末端位点)。v野生型的野生型的噬菌体噬菌体DNA具有太多的常用限制性具有太多的常用限制性核酸内切酶切割位点（核酸内切酶切割位点（5个个Eco R I酶切位点和酶切位点和7个个Hin d 酶切位点

42、）。这使它不适于用作酶切位点）。这使它不适于用作基因克隆的载体，想办法从野生型基因克隆的载体，想办法从野生型噬菌体基噬菌体基因组因组DNA上消去一些多余的酶切位点并切除非上消去一些多余的酶切位点并切除非必要区段，将它改造成适用于基因克隆的载体。必要区段，将它改造成适用于基因克隆的载体。介绍改造后的两种类型：介绍改造后的两种类型：v1插入型载体插入型载体 外源外源DNA克隆到插入型克隆到插入型载体分载体分子上，就会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，子上，就会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。根据插入失活效应的即所谓的插入失活效应。根据插入失活效应的特异性，可分为以下两种亚型。特

43、异性，可分为以下两种亚型。v(1)免疫功能失活插入型载体：载体的免疫功能失活插入型载体：载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两基因组中有一段免疫区，其中带有一两种限制性内切酶的单切割位点。当外源种限制性内切酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时，阻碍其片段插入到这种位点上时，阻碍其进入溶源周期。因此，凡带有外源进入溶源周期。因此，凡带有外源DNA插人的插人的重组体都只能形成清晰的噬菌重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。这种形态学上就会形成混浊的噬菌斑。这种形态学上的差异，为分离重组体分子提供了方便的差异

44、，为分离重组体分子提供了方便的标志。的标志。v(2)-半乳糖苷酶失活插入型载体：这种载半乳糖苷酶失活插入型载体：这种载体的基因组中含有大肠杆菌的体的基因组中含有大肠杆菌的lacZ区段，编区段，编码码-半乳糖苷酶。由这种载体感染大肠杆菌半乳糖苷酶。由这种载体感染大肠杆菌的的lac-指示菌，涂布在补加有指示菌，涂布在补加有IPTG和和X-gal的的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑，但在培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑，但在克隆过程中，如果外源克隆过程中，如果外源DNA插入到插入到lac5区段区段上，阻断了上，阻断了-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ的编码序的编码序列，那么由这种重组体感染的列，

45、那么由这种重组体感染的lac-指示菌，由指示菌，由于不能合成于不能合成-半乳糖苷酶，只能形成无色的半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。噬菌斑。2替换型载体替换型载体v又叫作取代型载体（又叫作取代型载体（substitution vector)，是在，是在噬菌体基础上改建的，在其中央部噬菌体基础上改建的，在其中央部分有一个可以被外源插入分有一个可以被外源插入DNA分子所取代分子所取代的的DNA片段。当外源片段。当外源DNA插人此类载体时，插人此类载体时，一对克隆位点之间的一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换片段便会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源掉，从而有效地提高了克隆外源DNA片段片段的能力

46、。的能力。v在在NM781替换型载体中，可取代的替换型载体中，可取代的Eco R I片段，编码有一个片段，编码有一个supE基因，这种基因，这种NM781噬菌体感染细胞后，其噬菌体感染细胞后，其lacZ基因的基因的突变琥珀被抑制，因此能在突变琥珀被抑制，因此能在X-gal琼脂培养琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。但是，如果这个基上产生出蓝色的噬菌斑。但是，如果这个具有具有supE基因的基因的Eco R I片段被外源片段被外源DNA取取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑。指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑。534 柯斯质粒

47、载体柯斯质粒载体v“Cosmid”一词是由英文一词是由英文“cos site-carring plasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点的质粒。柯斯质粒是一类由人工构末端位点的质粒。柯斯质粒是一类由人工构建的含有建的含有DNA的的cos序列和质粒复制子的特序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。殊类型的质粒载体。v柯斯质粒载体柯斯质粒载体pHC79质粒兼具了质粒兼具了噬菌体载噬菌体载体和体和pBR322质粒载体两方面的优点，其克隆质粒载体两方面的优点，其克隆能力为能力为3145kb，而且能够被包装成为具有，而且能够被包装成为具有感染能力的噬菌体颗粒。感染

48、能力的噬菌体颗粒。柯斯质粒载体的特点柯斯质粒载体的特点v第一，具有第一，具有噬菌体的特性。在克隆了合适长噬菌体的特性。在克隆了合适长度的外源度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效转染对粒之后，可以高效转染对噬菌体敏感的大肠噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的柯斯质杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的柯斯质粒粒DNA分子，能按照分子，能按照噬菌体噬菌体DNA同样的方同样的方式环化。式环化。v第二，具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体第二，具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此能像质粒具有质粒复制子，因此能像质粒DNA一样在一样在寄主细

49、胞内进行复制，并且能在氯霉素作用寄主细胞内进行复制，并且能在氯霉素作用下，获得进一步扩增。下，获得进一步扩增。v第三，具有抗菌素抗性基因，可供重组第三，具有抗菌素抗性基因，可供重组体分子选择。体分子选择。v第四，具有高容量的克隆能力。柯斯质第四，具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和两个选择记号和cos位点等三个组成部位点等三个组成部分，其分子较小，一般只有分，其分子较小，一般只有57kb左右。左右。因此，可以插入到载体上并能被包装成因此，可以插入到载体上并能被包装成噬菌体颗粒的最大外源噬菌体颗粒的最大外源DNA片段，克片

50、段，克隆极限可达隆极限可达45kb左右。左右。54 基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定v生命科学各个研究，生命科学各个研究，“克隆克隆”（clone)被广泛被广泛使用。通常克隆是无性繁殖。在不同层面的含使用。通常克隆是无性繁殖。在不同层面的含义：义：v在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的组成的群体群体；从同一受精卵分裂而来的单卵双从同一受精卵分裂而来的单卵双生子属于同一克隆。生子属于同一克隆。v在细胞水平上，克隆是指由同一个祖细胞分裂在细胞水平上，克隆是指由同一个祖细