最新大肠杆菌基因工程教学课件.ppt
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1、大肠杆菌基因工程A A A A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征征征征大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程大肠杆菌表达外源基因的优大肠杆菌表达外源基因的优大肠杆菌表达外源基因的优大肠杆菌表达外源基因的优势势势势全基因组测序,共有全基因组测序,共有全基因组测序,共有全基因组测序,共有4405440544054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架个开放型阅读框架个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作
2、方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国被美国被美国被美国FDAFDAFDAFDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物启动子启动子启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性启动子的可控性启动子的可控性P Placlac乳糖启动子乳糖启动子乳糖启动子乳糖启动子P Placlac的可控性:的可控性:的可控性:的可控性:OOP PlaclacOO高效转高效转高效转高效转录录录录葡萄糖代葡萄糖代葡萄糖代葡萄糖代谢谢谢谢野生型的野生型的野
3、生型的野生型的P Placlac上游附近拥上游附近拥上游附近拥上游附近拥有有有有代谢激活因子(代谢激活因子(代谢激活因子(代谢激活因子(CAPCAP)结合结合结合结合区,区,区,区,cAMPcAMP激活激活激活激活CAPCAP,CAPCAP基底水平转基底水平转基底水平转基底水平转录录录录结合启动子控制区,进结合启动子控制区,进结合启动子控制区,进结合启动子控制区,进而促而促而促而促进进进进P Placlac介导的转录。葡萄介导的转录。葡萄介导的转录。葡萄介导的转录。葡萄糖糖糖糖代谢使代谢使代谢使代谢使cAMPcAMP减少,也减少,也减少,也减少,也能阻能阻能阻能阻遏遏遏遏P Placlac介导
4、的转录。因此,介导的转录。因此,介导的转录。因此,介导的转录。因此,基因工程中使用的乳糖基因工程中使用的乳糖基因工程中使用的乳糖基因工程中使用的乳糖启动启动启动启动子均为抗葡萄糖代谢阻子均为抗葡萄糖代谢阻子均为抗葡萄糖代谢阻子均为抗葡萄糖代谢阻遏的遏的遏的遏的突变型,即突变型,即突变型,即突变型,即P Plac lac UV5UV5CACAP PcAMPcAMPcAMPcAMP浓度浓度浓度浓度降低降低降低降低P Plac lac UV5UV5OO高效转高效转高效转高效转录录录录启动子启动子启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性启动子的可控性启动子的可控性P Ptrptrp色氨酸启动子色氨酸启
5、动子色氨酸启动子色氨酸启动子PtrpPtrp的可控性:的可控性:的可控性:的可控性:OOtrptrp除去除去除去除去色氨色氨色氨色氨酸酸酸酸色氨酸启动子色氨酸启动子色氨酸启动子色氨酸启动子P Ptrptrp受色氨酸受色氨酸受色氨酸受色氨酸-阻遏阻遏阻遏阻遏蛋白复合物的阻遏,转录呈基底蛋白复合物的阻遏,转录呈基底蛋白复合物的阻遏,转录呈基底蛋白复合物的阻遏,转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸状态。在培养系统中去除色氨酸状态。在培养系统中去除色氨酸状态。在培养系统中去除色氨酸基底水平转基底水平转基底水平转基底水平转录录录录或者加入或者加入或者加入或者加入3-3-吲哚丙烯酸(吲哚丙烯酸(吲哚丙烯
6、酸(吲哚丙烯酸(IAAIAA),),),),便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中,除去在正常的细菌培养体系中,除去在正常的细菌培养体系中,除去在正常的细菌培养体系中,除去色氨酸是困难的,因此基因工程色氨酸是困难的,因此基因工程色氨酸是困难的,因此基因工程色氨酸是困难的,因此基因工程中往往添加中往往添加中往往添加中往往添加IAAIAA诱导诱导诱导诱导P Ptrptrp介导的目介导的目介导的目介导的目基因的表达基因的表达基因的表达基因的表达色氨色氨色氨色氨酸酸酸酸或加或加或加或加3-3-吲哚丙烯吲哚丙
7、烯吲哚丙烯吲哚丙烯酸酸酸酸高效转高效转高效转高效转录录录录阻遏蛋阻遏蛋阻遏蛋阻遏蛋白白白白 (IAAIAA)OOtrptrpP Ptrptrp高效转高效转高效转高效转录录录录OOtrptrpP Ptrptrp启动子启动子启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性启动子的可控性启动子的可控性l l l l噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体启动子启动子启动子启动子P PllLL的可控性:的可控性:的可控性:的可控性:噬菌体启动子噬菌体启动子噬菌体启动子噬菌体启动子P PLL受受受受CICI阻遏蛋白阻阻遏蛋白阻阻遏蛋白阻阻遏蛋白阻遏,很难直接诱导控制。在基因遏,很难直接诱导控制。在基因遏,很难直接诱导控制。在基
8、因遏,很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的工程中常使用温度敏感型的工程中常使用温度敏感型的工程中常使用温度敏感型的cIcI突突突突变基因变基因变基因变基因cIcI857857控制控制控制控制P PLL。cIcI857857阻遏蛋阻遏蛋阻遏蛋阻遏蛋在在在在4242时失活脱落,时失活脱落,时失活脱落,时失活脱落,P PLL便可介导便可介导便可介导便可介导目的基因的表达。但在大型细菌目的基因的表达。但在大型细菌目的基因的表达。但在大型细菌目的基因的表达。但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难,因培养罐中迅速升温非常困难,因培养罐中迅速升温非常困难,因培养罐中迅速升温非常困难,因此常使用一个
9、双质粒控制系统,此常使用一个双质粒控制系统,此常使用一个双质粒控制系统,此常使用一个双质粒控制系统,用色氨酸间接控制目的基因表达用色氨酸间接控制目的基因表达用色氨酸间接控制目的基因表达用色氨酸间接控制目的基因表达P PtrptrpAAB BcIcI857857P PLL目的基目的基目的基目的基因因因因阻遏作阻遏作阻遏作阻遏作用用用用P PtrptrpAAB BP PLL表表表表达达达达色氨色氨色氨色氨酸酸酸酸终止子终止子终止子终止子强化转录终止的必要性强化转录终止的必要性强化转录终止的必要性强化转录终止的必要性 外外外外源源源源基基基基因因因因在在在在强强强强启启启启动动动动子子子子的的的的控
10、控控控制制制制下下下下表表表表达达达达,容容容容易易易易发发发发生生生生转转转转录录录录过过过过头头头头现现现现象象象象,即即即即RNARNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶滑滑滑滑过过过过终终终终止子结构继续转录质粒上邻近的止子结构继续转录质粒上邻近的止子结构继续转录质粒上邻近的止子结构继续转录质粒上邻近的DNADNA序列,形成长短不一的序列,形成长短不一的序列,形成长短不一的序列,形成长短不一的mRNAmRNA混合物混合物混合物混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达,其原因如下:过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达,其原因如下:过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基
11、因的表达,其原因如下:过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达,其原因如下:转转转转录录录录产产产产物物物物越越越越长长长长,RNARNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶转转转转录录录录一一一一分分分分子子子子mRNAmRNA所所所所需需需需的的的的时时时时间间间间就就就就相相相相应应应应增增增增加加加加,外外外外源源源源基基基基因因因因本本本本身的转录效率下降;身的转录效率下降;身的转录效率下降;身的转录效率下降;如如如如果果果果外外外外源源源源基基基基因因因因下下下下游游游游紧紧紧紧接接接接有有有有载载载载体体体体上上上上的的的的其其其其它它它它重重重重要要要要基基基基因因因因或或或或DN
12、ADNA功功功功能能能能区区区区域域域域,如如如如选选选选择择择择性性性性标标标标记记记记基基基基因因因因和和和和复复复复制制制制子子子子结结结结构构构构等等等等,则则则则RNARNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶在在在在此此此此处处处处的的的的转转转转录录录录可可可可能能能能干干干干扰扰扰扰质质质质粒粒粒粒的的的的复复复复制制制制及及及及其其其其它它它它生生生生物物物物功功功功能能能能,甚至导致重组质粒的不稳定性;甚至导致重组质粒的不稳定性;甚至导致重组质粒的不稳定性;甚至导致重组质粒的不稳定性;过长的过长的过长的过长的mRNAmRNA往往会产生大量无用的蛋白质,增加工程菌无谓的能量消耗;往往会产
13、生大量无用的蛋白质,增加工程菌无谓的能量消耗;往往会产生大量无用的蛋白质,增加工程菌无谓的能量消耗;往往会产生大量无用的蛋白质,增加工程菌无谓的能量消耗;更更更更为为为为严严严严重重重重的的的的是是是是,过过过过长长长长的的的的转转转转录录录录物物物物往往往往往往往往不不不不能能能能形形形形成成成成理理理理想想想想的的的的二二二二级级级级结结结结构构构构,从从从从而而而而大大大大大大大大降降降降低低低低外外外外源源源源基基基基因编码产物的翻译效率因编码产物的翻译效率因编码产物的翻译效率因编码产物的翻译效率终止子终止子终止子终止子强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用强终止
14、子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是目前外源基因表达质粒中常用的终止子是目前外源基因表达质粒中常用的终止子是目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌来自大肠杆菌来自大肠杆菌来自大肠杆菌rRNArRNA操纵子上的操纵子上的操纵子上的操纵子上的rrnTrrnT11T T22以及以及以及以及T7T7噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA上的上的上的上的T Tf f f f。对于一些终止作用较对于一些终止作用较对于一些终止作用较对于一些终止作用较弱的终止子,通常可以采用二聚体终止子串弱的终止子,通常可以采用二聚体终止子串弱的终止子,通常可以采用二聚体终止子串弱的终止子,通常可以采
15、用二聚体终止子串联的特殊结构,以增强其转录终止作用联的特殊结构,以增强其转录终止作用联的特殊结构,以增强其转录终止作用联的特殊结构,以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样,通过特殊的终止子也可以象启动子那样,通过特殊的终止子也可以象启动子那样,通过特殊的终止子也可以象启动子那样,通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组探针质粒从细菌或噬菌体基因组探针质粒从细菌或噬菌体基因组探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNADNA中克隆中克隆中克隆中克隆筛选筛选筛选筛选pCPpCP1 1ApAprrorioriTcTcrr筛选筛选筛选筛选ApAprr、TcTcss的转化子的转化子的转化子的转化子核糖体结合
16、位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率,而且在很大程度上还与转录启动的频率,而且在很大程度上还与转录启动的频率,而且在很大程度上还与转录启动的频率,而且在很大程度上还与mRNAmRNA的翻译的翻译的翻译的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNAmRNA分子具有
17、不同的翻译效率,它们之间的差别有时可高达分子具有不同的翻译效率,它们之间的差别有时可高达分子具有不同的翻译效率,它们之间的差别有时可高达分子具有不同的翻译效率,它们之间的差别有时可高达数百倍。数百倍。数百倍。数百倍。mRNAmRNA翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其5 5 端的结构序端的结构序端的结构序端的结构序列所决定,称为列所决定,称为列所决定,称为列所决定,称为核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点(RBSRBS)核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素:
18、大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素:大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素:大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素:位位位位于于于于翻翻翻翻译译译译起起起起始始始始密密密密码码码码子子子子上上上上游游游游的的的的6-86-8个个个个核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸序序序序列列列列5 5 UAAGGAGG UAAGGAGG 33,即即即即Shine-Shine-DalgarnoDalgarno(SDSD)序序序序列列列列,它它它它通通通通过过过过识识识识别别别别大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌核核核核糖糖糖糖体体体体小小小小亚亚亚亚基基基基中中中中的的的的1616S S rR
19、NA rRNA 33端端端端区区区区域域域域3 3 AUUCCUCC AUUCCUCC 55并并并并与与与与之之之之专专专专一一一一性性性性结结结结合合合合,将将将将mRNAmRNA定定定定位位位位于于于于核核核核糖糖糖糖体体体体上上上上,从从从从而启动翻译;而启动翻译;而启动翻译;而启动翻译;翻翻翻翻译译译译起起起起始始始始密密密密码码码码子子子子,大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌绝绝绝绝大大大大部部部部分分分分基基基基因因因因以以以以AUGAUG作作作作为为为为阅阅阅阅读读读读框框框框架架架架的的的的起起起起始始始始位位位位点点点点,但有些基因也使用但有些基因也使用但有些基因也使用但有些基
20、因也使用GUGGUG或或或或UUGUUG作为翻译起始密码子;作为翻译起始密码子;作为翻译起始密码子;作为翻译起始密码子;SDSD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成;基因编码区基因编码区基因编码区基因编码区5 5 端若干密码子的碱基序列端若干密码子的碱基序列端若干密码子的碱基序列端若干密码子的碱基序列 核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核
21、糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSD序列的影响序列的影响序列的影响序列的影响:一般来说,一般来说,一般来说,一般来说,mRNAmRNA与核糖体的结合程度越强,翻译与核糖体的结合程度越强,翻译与核糖体的结合程度越强,翻译与核糖体的结合程度越强,翻译的起始效率就越高,而这种结合程度主要取决于的起始效率就越高,而这种结合程度主要取决于的起始效率就越高,而这种结合程度主要取决于的起始效率就越高,而这种结合程度主要取决于SDSD序列序列序列序列与与与与1616S rRNAS rRNA的碱基互补性,其中以的碱基互补性,其中以的碱基互补
22、性,其中以的碱基互补性,其中以GGAGGGAG四个碱基序列四个碱基序列四个碱基序列四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言,上述四个碱基中任何一个尤为重要。对多数基因而言,上述四个碱基中任何一个尤为重要。对多数基因而言,上述四个碱基中任何一个尤为重要。对多数基因而言,上述四个碱基中任何一个换成换成换成换成C C或或或或T T,均会导致翻译效率大幅度降低均会导致翻译效率大幅度降低均会导致翻译效率大幅度降低均会导致翻译效率大幅度降低 核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位
23、点对外源基因表达的影响SDSD序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响:SDSD序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为AAAAAAAA或或或或UUUUUUUU,翻译效率翻译效率翻译效率翻译效率最高;而最高;而最高;而最高;而CCCCCCCC或或或或GGGGGGGG的翻译效率则分别是最高值的的翻译效率则分别是最高值的的翻译效率则分别是最高值的的翻译效率则分别是最高值的50%50%和和和和25%25%。紧邻。紧邻。紧邻。紧邻AUGAUG的前三个碱基成份对翻译起始也的前三个碱基成
24、份对翻译起始也的前三个碱基成份对翻译起始也的前三个碱基成份对翻译起始也有影响,对于大肠杆菌有影响,对于大肠杆菌有影响,对于大肠杆菌有影响,对于大肠杆菌b b b b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNAmRNA而言,在而言,在而言,在而言,在这个位置上最佳的碱基组合是这个位置上最佳的碱基组合是这个位置上最佳的碱基组合是这个位置上最佳的碱基组合是UAUUAU或或或或CUUCUU,如果用如果用如果用如果用UUCUUC、UCAUCA或或或或AGGAGG取代之,则酶的表达水平低取代之,则酶的表达水平低取代之,则酶的表达水平低取代之,则酶的表达水平低2020倍倍倍倍核糖体结合位点核糖
25、体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSD序列与起始密码子之间的距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响:SDSD序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNAmRNA在核糖体上定位后,翻译起始密码子在核糖体上定位后,翻译起始密码子在核糖体上定位后,翻译起始密码子在核糖体上定位后,翻译起
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