植物组织培养实验之具体配置.ppt

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1、植物植物组织组织培培养实验养实验实验一 培养基贮备液（母液）的配制目的与要求目的与要求：熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法.实验步骤：实验步骤：称量 分别溶解 混合 定容。一，MS培养基的组成1、大量成分贮备液I mg/L NH4NO31650 KNO31900 CaCl2 2H2O 440 MgSO4 7H2O 370 KH2PO4 170 配制20倍浓度贮备液500mL.2、微量成分贮备液II mg/L H3BO3 MnSO4 4H2 ZnSO4 7H2 Na2MoO4 2H2 CuSO4 5H2 CoCl2 6H2配制100倍浓度贮备液100mL.3、铁贮备液III mg/L F

2、eSO4 7H2 Na2 EDTA 2H2 4、有机成分贮备液IV mg/L 肌醇 100 烟酸 盐酸硫胺素(VB1)盐酸吡哆醇 甘氨酸 2 配制100倍浓度贮备液100mL.配制100倍浓度贮备液100mL.二，常用生长调节剂6-BA：1mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。NAA:1mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。三、作业：（一）一般可将MS培养基分为哪四个部分？分别含有几种试剂？各种试剂的浓度（mg/L）如何？（二）如需配制MS培养基的20的贮备液I量为500 mL、100的贮备液II、III和IV各100 mL以及BA和NAA（浓度为1 mg/mL）各50

3、mL，则应分别称取多少量的各种试剂？注意要点有哪些？贮备液I(g)贮备液III(mg)MgSO47H2O3.70500mLFeSO4 7H2O 278 100mLNH4NO316.50Na2 EDTA 2H2O 373 CaCl22H2O4.40生长调节剂KNO319.006-BA50mg50mLKH2PO41.70NAA50mg50mL贮备液II(mg)贮备液IV(mg)KI 8.3 100mL肌醇 1000 100mLH3BO3 62 烟酸 5 MnSO4 4H2O 223 盐酸硫胺素 1 ZnSO4 7H2O 86 盐酸吡哆醇 5 Na2MoO4 2H2O 2.5 甘氨酸 20CuSO4

4、 5H2O 0.25 称量 溶解溶解溶解溶解 混合 定容CoCl2 6H2O 0.25 实验二 固体培养基的配制与灭菌 一、实验目的：学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法。二、实验步骤：称量 混合 调pH值 灭菌称量：称量：称量：称量：按每瓶培养基终体积50mL计，称取适量的琼脂（常用量8g/L）和蔗糖（常用量30g/L），置于大烧杯中，加蒸馏水至需配培养基终体积的3/4左右，（加热）使之溶解。混合：混合：混合：混合：分别加入一定量的贮备液I、II、III、IV和生长调节物质及其它特殊补加物，再加蒸馏水直至需配培养基的终体积。调调调调pHpHpHpH值：值：值：值：充分混合后，在60水

5、浴条件下用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl调节培养基的pH值至5.8。灭菌：灭菌：灭菌：灭菌：封严培养容器口后，120 灭菌20 min后，将培养基取出，置于水平台子上，在室温下下冷冷却，备用。实验三实验三 外植体材料的预处理、外植体材料的预处理、消毒及接种消毒及接种一、实验目的：熟悉外植体材料的预处理，掌握其消毒和接种方法。二、方法步骤：（一）对采来的植物材料进行适当的预处理。除去不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植物材料清洁程度而定。这在污染严重时特别有用。（二）用洗衣粉水（12角匙洗衣粉/100ml水）等浸洗上述植

6、物材料约5min，再用自来水冲净洗衣粉水。这是进一步减少污染的处理。同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。（三）将接种用具、无菌水等从80烘箱中或直接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。打开超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少30 min后关掉紫外灯。（四）操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作台上操作。（五）具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广

7、口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、浓度一定并且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液的0.5%，或每100 mL消毒液滴加1015滴）Tween-80（土温-80）等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料至少0.5 cm），开始计算灭菌时间。也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌1030秒。（六）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在灭菌时间结束前1 min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。一般表面灭菌时间的计算

8、是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止。无菌水的清洗时间每次约3 min；清洗5次。（七）倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植物材料的切割及接种。逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。如有必要，也可再行切分。在完成切割后，将解剖刀和小镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一切割再用。（八）接着，左手拿培养瓶，将培养容器口外壁在靠近酒精灯外焰处转燎数秒，以将其可能带有的微生物等固定于原处；在酒精灯焰附近处，用右手拇指与食指配合将瓶塞打

9、开，并将其夹于左手无名指与最小指之间；再将培养瓶口在酒精灯焰上轻转灼烧灭菌；以右手拇指与食指配合，用大镊子夹紧一外植体准确送入培养容器，并将其轻轻地半插入固体培养基；将大镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一操作再用；将培养瓶口及瓶塞分别在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒；盖好瓶塞，旋紧，将其置于超净工作台的适当位置。（九）在完成了该第一只培养容器的外植体接种操作后，用70%乙醇对超净工作台的台面进行擦拭灭菌，接着再进行第二只培养容器的外植体接种及超净台台面的灭菌，直至全部完成。三、作业：练习无菌操作；统计植物材料表面灭菌结果；分析污染原因；提出减少或避免污

10、染的措施。实验四实验四 枝芽增殖培养基的枝芽增殖培养基的设计与配制设计与配制 一、实验目的：学习、掌握枝芽增殖培养基的设计、配制方法。二、方法步骤：（一）称取4 g琼脂和15 g蔗糖，加蒸馏水至需配培养基终体积500 mL的3/4，加热使之溶解，并在80热水浴中保温。（二）分别加入一定量的MS培养基贮备液I、II、III和IV及NAA 0.25 mg，然后15各小组再分别加入各自不同量的BA（；1及1.5 mg）。（三）充分混匀后，用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl调节培养基的pH至。定容至500 mL。（四）将培养基分装到所选用的培养容器中，每个容器的装量不超过其最大

11、容量的1/3。拧紧瓶盖。（五）将装有培养基的培养容器置高压灭菌器中高压灭菌（120，20 min）。灭菌结束后从高压灭菌器中取出，置于平台上冷却，备用。三、作业：在进行枝芽增殖培养基设计时，应注意哪些问题？实验五实验五 枝芽增殖培养的外植体的枝芽增殖培养的外植体的处理与接种处理与接种 一、实验目的：学习、掌握枝芽增殖培养外植体的处理、接种方法。二、方法步骤：（一）将经湿热灭菌装有培养基的培养容器、接种用具等置于超净台上，打开超净台的紫外灯，灭菌处理30 min。（二）操作人员坐到超净台前，用浸有70%酒精的棉球擦超净台面、操作者手等部分。（三）点燃酒精灯，从装有无菌苗的培养瓶中取出无菌苗，置于

12、无菌的培养皿中的无菌滤纸上，用灭过菌的刀和镊子配合操作，从叶柄处切下，将所有叶片去除，只留下近茎部的一小段叶柄。（四）将去除叶片后的茎，切分成带腋芽的茎段。(五）打开培养容器盖子，将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基，盖好培养容器盖子，置于超净台上适当位置。对接种用具、超净台面、操作者手等进行适当灭菌处理，继续接种。如此操作，直至完成。三、作业：进行增殖试验结果的观测、比较、记录和分析。实验六实验六 根再生诱导培养基的根再生诱导培养基的设计与配制设计与配制 一、实验目的：学习、掌握一、实验目的：学习、掌握根再生诱导培养基根再生诱导培养基的设计、的设计、配制方法。配制方法。二、方法步骤：（一）称取4g琼脂和15g蔗糖，加蒸馏水至需配培养基终体积500 mL的3/4，加热使之溶解，并在80热水浴中保温。（二）分别加入一定量的MS培养基贮备液I、II、III和IV，然后15各小组再分别加入各自不同量的NAA（；1及 mg）。（三）充分混匀后，用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl调节培养基的pH至。补加蒸馏水至培养基的终体积500 mL。（四）分装后，将装有培养基的培养容器置高压灭菌器中高压灭菌（120，20 min）。（五）将灭过菌的装有培养基的培养容器从高压灭菌器中取出，置于平台上冷却，备用。三、作业：在进行根再生诱导培养基设计时，应注意哪些问题？