(2)--免疫印迹生物化学与分子生物学实验.ppt

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1、蛋 白 质 印 迹1、理解蛋白质印迹的原理2、掌握蛋白质印迹的流程3、蛋白质印迹常见问题的分析实验目的蛋白质印迹一种将凝胶电泳与固相免疫结合起来的分子生物学技术。在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。SDS-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）转膜固相免疫学检测一、SDS-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）SDS-聚丙烯酰胺电泳是蛋白质分离的最常用技术，利用该电泳分离蛋白质是取决于蛋白质的大小，即蛋白质的分子量。SDS十二烷基磺酸钠阴离子去污剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了

2、蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。一、SDS-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）不连续的电泳缓冲体系。浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）（0.5-1cm）。分离胶：由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电

3、荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。(PH为8.8)。二、转膜要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜、尼龙膜及PVDF膜）上，通常有两种方法：毛细管转移法和电泳转移法。“三明治”二、转膜常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中Buffer半干转将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间三、固相免疫学检测转移结束后，借助抗原抗体反应，利用ECL（增强化学发光）发光或DAB（3,3二氨基联苯胺）显色技术检测固相膜上目的蛋白质。封闭 抗体孵育显影

4、洗膜液TBST：Tris-base 2.42 g（pH 7.6），NaCl 8.0 g，Tween-20 1ml，定容至1000ML 洗 膜非离子型去污剂三、固相免疫学检测封闭 封闭的作用是封闭膜上非特异性位点，防止抗体非特异性地结合在膜上。脱脂奶粉（5）BSA（3%）蛋白质印迹膜封闭液（生物试剂公司提供）ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking Agent三、固相免疫学检测Primary antibodySecondary antibody抗体孵育一抗（Primary antibody）：能和非抗体性抗原(特异性抗原)特异性结合的蛋

5、白质。二抗（Secondary antibody）：能与一抗结合，即抗体的抗体，利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，检测一抗的存在，放大一抗的信号。显影利用抗体耦联的生色基团检测定量或定性检测目标蛋白质。ECL显影 DAB显影 蛋白质印迹常见问题分析。原因1.胶板不干净2.两块玻璃板底部未对齐3.加入AP和TEMED的不合适4.加入试剂后摇匀延迟5.电泳时温度过高现象1.胶不平？2.凝胶漏液？。现象1.条带比正常的窄？2.“微笑”或“倒微笑”条带？原因原因1.1.凝胶聚合不均匀凝胶聚合不均匀2.2.加样孔异常加样孔异常3 3.胶胶板底部有板底部有气泡气泡4.4.样品样品盐浓度盐浓度过高过高。原因1.膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染3.抗体与封闭剂出现交叉反应4.抗体浓度过高现象背景过高，或者条带杂乱。现象条带出现黑色杂点原因1.制胶化学试剂过期2.封闭液未完全溶解。现象无信号或者信号弱原因1.抗原不充足2.转膜不当3.抗体孵育不足4.洗膜过度感感 谢谢 聆聆 听听