机械力对骶韧带成纤维细胞形态及合成功能的调节.pdf

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。，f”：l，j：一：一?j 一，。=。卜、：，乒：二j?r。j!。ii 童；毽，：。咎“心，、；二级学院领导盖章少I 扣，厂珲一占月日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注等内容外，文中不包

2、含其他人已发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。酶辛托新签弘1 年|6 只lE t章o，2饥醛责到鞠导法矿L了矽臌讫应芦盹单日一台担名承签，生“J可L则究否研目录中文摘要1英文摘要4研究论文机械力对骶韧带成纤维细胞形态及合成功能的调节前言8日U 吾6材料与方法8结果1 4多口歹1 1-r附图16附表2 3讨论2 6结论2 9参考文献2 9综述张力完整性结构与盆底功能障碍性疾病3 2致谢4 5个人简历4 6中文摘要机械力对骶韧带成纤维细胞形态及合成功能的调节摘要目的：女性盆腔器官脱垂(p e l v i co r g a np r o l a p s e，

3、P O P)是盆底支持组织因退化、损伤等导致肌肉韧带松弛而引发的一类疾病。其病因学还不十分清楚，研究【1】多指向I 型胶原、I I I 型胶原、M M P、T I M P 等细胞外基质成分的改变，认为细胞外基质重塑引起组织力学性能的下降是该病的关键因素。所以本研究旨在：1 研究机械力对非P O P 患者骶韧带成纤维细胞形态及整合素p l(i n t e g r i n l 3 1)、T a l i n、I、I I I 型胶原、基质金属蛋白酶1(m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e 1，M M P 1)m R N A 表达的调节。2 研究机械力

4、与细胞外基质重塑的关系。3 探究机械力在女性盆腔器官脱垂(p e l v i co r g a np r o l a p s e，P O P)发病机制中的作用。方法：1 研究对象：选取2 0 0 9 年1 0 月2 0 1 0 年9 月在河北医大二院因非P O P(恶性肿瘤除外)行子宫切除手术患者的骶韧带1 5 例，平均年龄4 9 6 4-4 2 6岁，产次2 7 34-1 2 7 次，体重指数2 4 7 54-2 4 4 k g m 2。所有入选者均无结缔组织疾病，术后病理证实为非子宫内膜异位症、非卵巢内分泌性肿瘤等雌激素相关疾病，剔除急慢性盆腔炎和盆腔炎后遗症的患者，剔除有该部位手术史者及

5、近3 个月内有雌激素应用史者。2 取材：经河北医科大学第二医院伦理委员会同意，所有患者签署知情同意书。所取标本为骶韧带近宫颈部分，筋膜外子宫全切时留取约5 m m 左右的骶韧带组织，4 C 冷盒送实验室，整个取材运输过程小于2 小时。整个取材过程要求严格无菌。3 成纤维细胞的原代培养和鉴定：采用胶原酶消化法和组织块法进行骶韧带成纤维细胞的原代培养，倒置相差显微镜进行细胞形态学观察，免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。4 细胞力学实验：采用F l e x c e r c e l l 4 0 0 0 柔性基底拉伸加载系统，选取1 5例3-,4 代指数生长期的骶韧带成纤维细胞通过f l e x c e l

6、 l 4 0 0 0 柔性基底加中文摘要载系统加载、加力，加载过程在二氧化碳培养箱内进行。实验样本培养于特制的一次性六孔B i o F l e x 培养板上，材质为可变形的硅胶柔性膜，其上包被有c o l l a g e nI。加载程序由F l e x c e r c e l l 4 0 0 0 计算机软件自动控制。加载参数：幅度1 0，正弦波，0 5 H z，加载时间分为0、4、1 5、2 4 h，以不加力0 小时为对照组，卸载后立即提取R N A，采用荧光实时定量P C R测量机械力对i n t e g r i n1 31、t a l i n、I、I I I 型胶原、基质金属蛋白酶1(m

7、a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e 1，M M P 1)m R N A 表达量的影响。结果：1 所培养细胞为成纤维细胞，光镜下细胞以梭形为主，也可见到不规则三角形、多角形等各种形状的细胞，并彼此连接成网状。免疫组织化学染色中间丝波形蛋白(v i m e n t i n)阳性，细胞纯度9 0 4，平滑肌肌动蛋白(QS M A)染色约8 3 1 j B 性率，角蛋白(c y t o k e r a t i n)染色阴性。2 应力作用后，细胞的形态和伸展方向发生改变；拉伸前细胞形态多样，梭形为主，也可见到不规则三角形、多角形等各种形状的细胞，并彼此连

8、接成网状，向各个方向伸展；拉伸4 h、1 5 h、2 4 h 后细胞均为长梭形，并垂直于最大应变方向取向，以2 4 小时最明显。3 荧光实时定量P C R 结果：应力作用下，i n t e g r i n l 3 1m R N A 4 h、1 5 h、2 4 h表达量(18 8 2 2 0 5 0 0，3 2 5 2 7 2 5 5 9，4 0 3 5 7 _ _ 2 1 4 0)较O h(1 0 0 8 0 0 5 9)显著升高，各组间差异均有统计学意义，p 0 0 5，余各组间差异均有统计学意义，p 0 0 1；I 型胶原m R N A4 h、1 5 h 表达量(O 7 5 30 0 7

9、5，0 7 0 1 0 0 2 3)较O h(1 0 0 0 O 1 2 9)下降，差异有统计学意义，p O 0 5；I I I 型胶原m R N A 4 h、1 5 h、2 4 h 表达量(4 7 9 2 0 0 3 6，6 1 4 6 0 5 9 4，5 0 2 1 0 5 9 4)较O h(1 0 0 0 0 2 4 9)显著升高，2 4 h 与4 h差异无统计学意义，余各组间差异有统计学意义，p 0 0 1；M M P 1 m R N A4 h、1 5 h、2 4 h 表达量(6 2 3 3 0 6 5 1，2 3 7 0 0 0 9 0 0，2 0 1 3 3 O 7 5 1)较O

10、h(1 0 0 0 0 1 0 0)升高，各组间差异有统计学意义，P O 0 1。结论：1 一定范围的机械应力可以改变细胞的形态和伸展方向，并引起2i n t降先23型英文摘要R e g u l a t i o no fm o r p h o l o g ya n ds y n t h e s i sf u n c t i o nb ym e c h a n i c a ls t r e t c hi nh u m a nu t e r o s a c r a ll i g a m e n tf i b r o b l a s t sA B S T R A C To b j e e t i v

11、 e：1T os t u d yr e g u l a t i o no fm e c h a n i c a ls t r e t c ho nt h em o r p h o l o g ya n di n t e g r i n l 31，t a l i na n de x t r a c e l l u l a rm a t r i xm R N Ae x p r e s s i o no ff i b r o b l a s t sd e r i v e df r o mh u m a nu t e r o s a c r a ll i g a m e n tw h oa len o

12、 ts u f f e r i n gf r o mp e l v i co r g a np r o l a p s e 2T oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h em e c h a n i c a ls t r e t c ha n dt h ee x t r a c e l l u l a rm a t r i xr e m o d e l i n g 3T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fm e c h a n i c a ls t

13、r e t c ho nt h ep e l v i cf l o o rd y s f u n c t i o n M e t h o d s：1T h es u b je c t s：15P a t i e n t sw i t h o u tp e l v i co r g a np r o l a p s ea n dm a l i g n a n tt u m o r sw h ou n d e r w e n th y s t e r e c t o m ys u r g e r yi nt h eO b s t e t r i ca n dG y n e c o l o g i

14、c a lD e p a r t m e n to ft h eS e c o n dH o s p i t a lo fH e b e iM e d i c a lU n i v e r s i t yf r o mO c t o b e r2 0 0 9t oS e p t e m b e r2 010w e r er e c r u i t e di nt h i ss t u d y T h ea v e r a g ea g eo ft h ep a t i e n t si s4 9 6 4 2 6y e a r so l d，t h ea v e r a g et i m eo

15、fp a r i t yi s2 7 3 1 2 7，t h ea v e r a g eb o d ym a s si n d e xi s2 4 7 5+_ 2 4 4 k g m 2 A l lt h er e c r u i t e dw o m e nw e r en o ts u f f e rf r o mc o n n e c t i v et i s s u ed i s e a s e sa n dP a t h o l o g i c a l l yc o n f i r m e dn o n-e n d o m e t r i o s i s，n o n-e s t r

16、 o g e n r e l a t e do v a r i a nt u m o r s E x c l u d i n ga c u t ea n dc h r o n i cc o m p l i c a t i o n si np a t i e n t sw i t hp e l v i ci n f l a m m a t o r yd i s e a s e E x c l u d i n gt h o s ep a t i e n t sw h oh a dt h es u r g e r yi nt h eu t e r o s a c r a ll i g a m e n

17、 t a ls i t ea n dh a v eah i s t o r yo fe s t r o g e na p p l i c a t i o nw i t h i nt h ep a s t3m o n t h s 2s p e c i m e n：A f t e ro b t a i n i n gt h ea g r e e m e n to ft h eE t h i c sC o m m i t t e eo fT h eS e c o n dH o s p i t a lo fH e b e iM e d i c a lU n i v e r s i t y，a l lp

18、 a t i e n t ss i g n e di n f o r m e dc o n s e n t T h es p e c i m e n sw e r et a k e nf r o mp a r to ft h es a c r a ll i g a m e n tn e a rt h ec e r v i x，a b o u t5 m mo rs os a c r a ll i g a m e n t a ls p e c i m e n sw e r eo b t a i n e di nt h eh y s t e r e c t o m yo fe x t r af a

19、s c i a，k e e pf r e s hi n4 c o l db o x e sa n ds e n tt ot h e4荚又摘要一一_l a b o r a t o r yi m m e d i a t e l y，t h ew h o l ep r o c e s si sl e s st h a n2h o u r sa n dr e q u i r e ss t r i c ts t e r i l e 3P r i m a r yc u l t u r e da n di d e n t i f i c a t i o no ft h ef i b r o b l a s

20、t s：F i b r o b l a s t so fs a c r a ll i g a m e n td e r i v e df r o mo l dw e m e nw e r ec u l t u r e db yc o l l a g e n a s ed i g e s t i o na n dt i s s u ei n o c u l a t i o nm e t h o d，t h ec u l t u r e dc e l l sw e r ei d e n t i f i e db ym o r p h o l o g yw i t hl i g h tm i c r

21、 o s c o p ea n dt h ec e l l s c e r t a i na n t i g e n sw e r ed e t e c t e dw i t hi m m u n o c y t o c h e m i c a lm e t h o d 4E x p e r i m e n t a lm e t h o d sf o rm e c h a n i c a l l ys t i m u l a t i n gt h ec e l l si nv i t r o：U s i n gF l e x c e r c e l l 4 0 0 0t e n s i o n

22、s y s t e m，f i b r o b l a s t so f3 一-5g e n e r a t i o n so fe x p o n e n t i a lp h a s eo fg r o w t hd e r i v e df r o m15c a s e sw e r es t r e t c h e df o r0,4，15，2 4h o u r s，u s i n g0h o u r sa st h ec o n t r o lg r o u p T h el o a d i n g p r o c e s si si nt h ei n c u b a t o r-

23、C 0 2 E x p e r i m e n t a ls a m p l e sw e r ec u l t u r e di nas p e c i a ld i s p o s a b l eB i o F l e xp l a t e sw h i c hi sm a d eo ff l e x i b l es i l i c o n em e m b r a n et h a tc a nb ed e f o r m e da n di ti sc o v e r e db yc o l l a g e nI T h eL o a d i n gp r o c e d u r e

24、i sa u t o m a t i c a l l yc o n t r o l l e db yt h eF l e x c e r c e l l 4 0 0 0s o f t w a r e L o a d i n gp a r a m e t e r s：a m p l i t u d e10，s i n ew a v e，O 5 H z T o t a lR N AW a Se x t r a c t e d 舶mt h ef i b r o b l a s t si m m e d i a t e l ya f t e ru n l o a d i n ga n dt h ee

25、x p r e s s i o no fm R N Ao fi n t e g r i n l 31，t a l i n，C o l l a g e nI，C o l l a g e nI I Ia n dm a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e 1w e r em e a s u r e db yR e a l-t i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v eP C R R e s u l t s：1T h ef i b r o b l a s t ss h o ws p i n d l

26、 es h a p em a i n l ya n dc a na l s os h o wt h ei r r e g u l a rt r i a n g l e s，p o l y g o n sa n do t h e rs h a p e si nL i g h tm i c r o s c o p e T h ec e l l sc o n n e c t e dt oe a c ho t h e ra n df o r man e t w o r ks t r u c t u r e T h ev i m e n t i ni s9 0 4 p o s i t i v ei ni

27、 m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g，s m o o t hm u s c l ea c t i n(仅S M A)i sa b o u t8 3 p o s i t i v ea n dk e r a t i n(c y t o k e r a t i n)i sn e g a t i v e 2I nr e s p o n s et om e c h a n i c a ls t r e t c h，t h em o r p h o l o g ya n do r i e n t a t i o no ft h eu t e

28、 r o s a c r a ll i g a m e n tf i b r o b l a s t sw e r ec h a n g e d T h em o r p h o l o g yo ft h ef i b r o b l a s t si sv a r ie t yf r o ms p i n d l e(m a i n l y)t ot h ei r r e g u l a rt r i a n g l e s，p o l y g o n sa n do t h e rs h a p e sb e f o r es t r e t c h i n g T h ec e l l

29、 sc o n n e c t e dt oe a c ho t h e r 趴df o m lan e t w o r ks t r u c t u r e，s t r e t c h e di na 1 1d i r e c t i o n s A f t e rs t r e t c h e df o r4 h，15 h，2 4 h，t h es h a p eo ft h ef i b r o b l a s t sa r ea l ls p i n d l ea n dt h ed i r e c t i o no ft h ef i b r o b l a s t s英文摘要p e

30、 r p e n d i c u l a rt ot h eo r i e n t a t i o no ft h em a x i m u ms t r a i n，t h ec h a n g e so f2 4h o u r s s t r e t c h i n gi st h em o s to b v i o u s 3I nr e s p o n s et Om e c h a n i c a ls t r e t c h t h es y n t h e t i cf u n c t i o no ft h eu t e r o s a c r a ll i g a m e n

31、 tf i b r o b l a s t sw e r ec h a n g e d T h ei n t e g r i n l 31m R N Af o r4，15，2 4h o u r s s t r e t c h(1 8 8 2 2+0 5 0 0，3 2 5 2 7 士2 5 5 9，4 0 3 5 7 士2 1 4 0)w e r eu pr e g u l a t e dc o m p a r e dw i t h0h o u r(1 0 0 8 士0 0 5 9)，P 0 01 n l ee x p r e s s i o n so ft a l i nm R N Af o

32、 r4，1 5，2 4h o u r s s t r e t c h(1 0 9 8 0 4 士4 8 6 1，1 0 6 5 7 4 士3 5 4 7 7，8 6 3 2 0 6 士4 4 2 9 8)w e r eu pr e g u l a t e dc o m p a r e dw i t h0h o u r(1 0 0 9 士0 4 6 8)，e x c e p t4 h&15 h，t h eo t h e rg r o u p sw e r e s t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n t，p 0 01 c o l l a g e nIm R

33、 N Af o r4，15h o u r s s t r e t c h(0 7 5 3 士0 0 7 5，0 7 01 土0 0 2 3)w e r ed o w nr e g u l a t e dc o m p a r e dw i t h0h o u r(1 0 0 0 士0 12 9)，P 0 01，b u tf o r2 4h o u r s t r e t C h，t h em R N Ae x p r e s s i o n(1 113 士0 0 4 9)o fI-t y p ec o l l a g e nw e r er e s t o r e dt ot h el e v

34、 e lo f0h o u r s T h ee x p r e s s i o n so fc o l l a gI I I m。一r4，15，2 4hoursstretchhourso tc o l l a g e nI I I m R N Af o r42 4h o u r s。，(4 7 9 2 士0 0 3 6，6 1 4 6 士0 5 9 4，5 0 2 1 士0 5 9 4)w e r eu pr e g u l a t e dc o m p a r e dw i t h0h o u r(1 0 0 8 士0 2 4 9)，e x c e p t4 h&2 4 h，t h eo

35、t h e rg r o u p sw e r es t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n t，P 0 01 啪-l m R N Af o r4，15，2 4h o u r s s t r e t c h(6 2 3 3 士0 6 51，2 3 7 0 0+0 9 0 0，2 0 1 3 3 士0 7 5 1)w e r eu pr e g u l a t e dc o m p a r e dw i t h0h o u r(1 0 0 0 士0 1 0 0)，P 0 0 1 C o n c l u s i o n s：1T h em e c h a n

36、i c a ls t r e s sc a nc h a n g em o r p h o l o g ya n do r i e n m t i o no ft h ef i b r o b l a s t s，a n dp r o m o t et h es y n t h e s i so fm R N Ao fi n t e g i m l 31a n dt a l i nc o n t i n u o u s l y A tt h eb e g i n n i n go fL o a d i n g，t h ee x p r e s s i o no fr n R N Ao fIc

37、o l l a g e nd e c r e a s e d，t h e nr e s t o r e dt oi t so r i g i n a ll e v e la f t e r2 4h o u r s s t r e t c h 1 1 1 es y n t h e s e so fC o l l a g e n1 1 Ia n d 脚-1w e r ei n c r e a s e da tf i r s t，b u td e c r e a s e da f t e r2 4h o u r s s t r e t c h 2E x t r a c e l l u l a rm

38、a t r i xr e m o d e l i n gi np e l v i cf l o o ri sa na d a p t i v er e s p o n s et om e c h a n i c a lf o r c e 3M e c h a n i c a lf o r c em a y b ep l a ys o m er o l ei nt h ep a t h o g e n i cm e c h a n i s mo fP O P K e yw o r d s：P e l v i co r g a np r o l a p s e；C y t o m e c h a

39、n i c s；i n t e g r i n 31；t a l i n；6C o l l a g研究论文机械力对骶韧带成纤维细胞形态及合成功能的调节_ 上_ J 一刖罱女性盆腔器官脱垂(p e l v i co r g a np r o l a p s e，P O P)是盆底支持组织因退化、损伤等导致肌肉韧带松弛而引发的一类疾病。其病因学还不十分清楚，研究【l】多指向I 型胶原、I I I 型胶原、M M P、T I M P 等细胞外基质成分的改变，认为细胞外基质重塑引起组织力学性能的下降是该病的关键因素。女性盆底组织处于妊娠、分娩、腹压等复杂的生物力学环境中，机械力在P O P 的发病机制

40、中应起着重要的作用【2】。近年来，人们发现，一直以来被忽视的物理力在生命体内起着同化学因子同样重要的作用，是生命赖以存活的环境因素之一，是细胞命运的决定者【3】。I n g b e r【4】的张力完整性结构理论向我们揭示了机械力是如何塑造了生命体，并以怎样的方式影响细胞增殖、分化、运动和凋亡等生命活动的。成纤维细胞是合成和分泌细胞外基质并对力产生应答的细胞，E C M 整合素(i n t e g r i n s)t a l i n 细胞骨架系统是细胞感受和传导机械应力的结构基础【5】，如图1 所示，并与组织功能的维持和损伤修复密切相关。我们追溯机械力在细胞外基质改变中的作用，通过F l e x

41、 c e l l 4 0 0 0 柔性基底拉伸系统，对体外原代培养的非P O P 患者骶韧带成纤维细胞加载、加力，旨在探讨机械力对维持盆底功能起主要作用的骶韧带成纤维细胞的影响。材料与方法1 材料1 1 研究对象：选取2 0 0 9 年1 0 月2 0 1 0 年9 月在河北医大二院因非P O P(恶性肿瘤除外)行子宫切除手术患者的骶韧带1 5 例，平均年龄4 9 6 4-4 2 6 岁，产次2 7 3 1 2 7 次，体重指数2 4 7 5 2 4 4 k g m 2。所有入选者均无结缔组织疾病，术后病理证实为非子宫内膜异位症、非卵巢内分泌性肿瘤等雌激素相关疾病，剔除急慢性盆腔炎和盆腔炎后遗

42、症的患者，剔除有该部位手术史者及近3 个月内有雌激素应用史者。取材经河北医科大学第二医院伦理委员会同意，所有患者签署知情同意书。研究论文1 2 试剂1 2 1 蒸馏水：为省四院制剂室制备的新鲜双蒸水，再用1 5 磅高压2 0 分钟灭菌，4 保存备用。1 2 2P B S 的配制：将药品(N a C l8 0 9，K C l0 2 9，N a 2 H P 0 4 1 2 H 2 03 4 9 9，K H 2 P 0 40 2 9)倒入盛有双蒸水的烧杯中，磁力搅拌器搅拌混匀(约3 0分钟)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1 0 0 0 m l。(必要时用H C l 或N a O H 调

43、P H 到7 4)。分装于2 5 0 m l 玻璃瓶中，高压灭菌，4。C 保存备用。1 2 3 青、链霉素溶液：(华北制药股份公司)所用纯净水(双蒸水)需要1 5 磅高压2 0 分钟灭菌。具体操作均在超净台内完成。青霉素是8 0 万单位瓶，用注射器J J D 4 m!灭菌双蒸水。链霉素是1o o 万单位瓶，3 D 5 m l 灭菌双蒸水，即每毫升各为2 0 万单位。分装于一2 0 保存。使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为1 0 0 单位m l。1 2 40 2 5 胰蛋白酶溶液和0 2 5 胰蛋白酶-0 0 2 E D T A：O 2 5 胰蛋白酶溶液：用电子天平准确称取胰蛋白酶粉剂(

44、美 S i g m a)0 2 5 9 溶入高压灭菌的P B S1 0 0 m l，磁力搅拌器搅拌混匀(约3 0 分钟)，配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(O 2 2 微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于一2 0 保存以备使用。O 2 5 胰蛋白酶一O 0 2 E D T A(乙二胺四乙酸二钠，华美生物工程公司)溶液：用电子天平准确称取E D T AO 0 2 9，加入配制好的0 2 5 胰蛋白酶溶液1 0 0 m l，磁力搅拌器搅拌混匀(约3 0 分钟)，在超净台内用0 2 2 u m微孔滤膜过滤除菌，分装，于-2 0 保存。1 2 5 冻存液的配置：5 0 D M E M 培养液、

45、4 0 胎牛血清、1 0 的二甲基亚砜(D M S O)。1 2 6 血清的灭活：胎牛血清(2 0 D M，杭州四季青)，新买来的血清要在5 6 水浴中灭活3 0 分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。1 2 7I 型胶原酶的配置：I 型胶原酶购自美国S i g m a 公司：将I 型胶原酶1 0 0 m g 溶于高压灭菌的P B S1 0 m l，磁力搅拌器低速搅拌混匀(约3 0 分钟)，配制成1 0 m g m l，在超净台内用0 2 2 u m 微孔滤膜过滤除菌，分装于1 5 m l的E P 管中，每管0 5 m l，于-2 0 保存。用时用D M E M 培养基稀释1 0倍(终浓度为

46、O 1)。9研究论文1 2 8 高糖D M E M 培养基：(D u l b e c c o Sm o d i f i e dE a g l e Sm e d i u m)购自美国G i b c o 公司，抽滤分装4 C 保存备用。1 2 9 其他试剂：抗波形蛋白、抗细胞角蛋白和平滑肌肌动蛋白单克隆抗体、D A B 显色试剂盒、P V 非生物素二步法免疫组化检测试剂盒均购自北京中杉金桥，R N A 提取试剂(美国，I n v i t r o g e n)，反转录试剂盒(立陶宛，F e r m e n t a s)，荧光定量P C R 试剂盒(T a K a R a，D R R 0 4 1 A)

47、。1 3 仪器：C 0 2 培养箱(5 C 0 23 7。C，饱和湿度，日本，S a n Y o)，倒置相差显微镜及微摄影系统(日本，O l y m p u s)，显微镜摄像系统(日本，N i k o n)，超净台(E S C O，新加坡)，蒸馏水机(中国山东潍坊，L D 5 6 0 4 型)，一次性培养瓶(美国，C o r i n g)，荧光定量P C R 仪(美国A B I 公司，7 5 0 0 型)。细胞加载系统(F l e x c e l l 4 0 0 0，美国)由山西理工大学应用力学与生物医学工程研究所提供。2 方法步骤2 1 原代细胞培养2 1 1 胶原酶消化法：所取标本为骶韧带

48、近宫颈部分，术中子宫全切时留取约5 m m 左右的骶韧带组织，待子宫切除后，立即将骶韧带组织置于，立即置于含青霉素1 0 0 u m l 和链霉素1 0 0 u m l 的P B S 液中漂洗2 3 次，切成3 m m 5 m m 的小块，置于无血清4 的D M E M 液中，40 C 冷盒送实验室，整个取材运输过程小于2 小时。整个取材过程要求严格无菌。于超净台内，清除组织块表面血块、坏死组织、脂肪，用锋利的眼科剪将组织快速剪成约l m m 大小的碎块，减少对细胞的机械损伤，剪切过程中用D M E M 液保持湿润，将剪好的组织小块用吸管送入培养瓶内，加入含1 1 型胶原酶的D M E M5

49、m l，3 7，1 8 0 r p m 振荡消化约2 3 小时，每隔半小时观察消化情况，待组织块膨松呈絮状，光镜下观察有细胞游出，终止消化。先用单层无菌纱布过滤组织块，再用2 0 0 目的筛网过滤，收集上清，1 0 0 0 r p m，离心5分钟，弃上清，P B S 洗两次去除胶原酶，用含2 0 F B S 的D M E M 重悬，置于培养箱内(5 C 0 23 7 饱和湿度)旋松瓶盖，半开放培养。标记取材部位、日期、代数、培养方法。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录。开始培养后，每隔3 d 更换一次培养液。当原代培养后成纤维细胞在培养瓶底表面生长至8 0 9 0 汇合后，进

50、行传代，经过2 3 传代后，能获得l O研究论文较纯的成纤维细胞。2 1 2 组织块法：培养标本取材同胶原酶消化法，于超净台内在平皿内用眼科剪将组织块剪成约l m m 大小的碎块，并用含2 0 F B S 的D M E M 保持其湿润，将剪好的组织小块用吸管送入培养瓶内，用牙科探针将组织块在瓶壁上摆放均匀，每小块间距3 5 m m 左右。组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，使有组织块的一面朝上，向瓶内滴入2 0 F B S 的D M E M 培养液约2 m l，盖好瓶盖，旋松，将培养瓶放置培养箱内(5 C 0 23 7 饱和湿度)。3-4 4 x 时后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养，第二天向瓶