MDCK细胞培养技术操作规范.doc

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1、MDCK细胞培养技术操作规范（一）生物安全级别和生物安全规定1. MDCK细胞培养实验室生物安全级别：正常MDCK细胞培养在生物安全二级实验室进行。2. MDCK细胞培养实验室生物安全规定：遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。（二）MDCK细胞的传代培养步骤1. 细胞培养所需的材料（部分试剂在此列出生产厂家货号仅供参考，可自行选择）：（1） 生长成片的MDCK细胞；（2） T-75细胞培养瓶,颈口有倾角；（3） D-MEM培养液；（4） 青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G；10,000g/mL硫酸链霉素)，分装后保存于-20；（5） HEPES缓冲液，1M母液；（6） 胎牛血清；（

2、7） EDTA-胰酶(0.05胰酶；0.53mMEDTA4Na)（Gibco CatNo. 25300-062），分装后保存于-20；（8） 牛血清白蛋白组分V，7.5溶液（GIBCO CatNo. 15260）；（9） 1mL和10mL无菌移液管等；（10） 7075的酒精。建议：经常检查试剂使用的有效期和MDCK细胞的代数。2. 培养基和试剂的准备:（1） 500mL的D-MEM液中加入a) 青、链霉素母液5mL(终浓度达:100U/mL青霉素和100g/mL链霉素)；b) HEPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)；c) 7.5牛血清白蛋白组分V12.5mL。d) 加入7.5%Na

3、HCO310-15mL（终浓度：2-3%)（2） 细胞生长液10mL胎牛血清加到90mL的上述D-MEM液，使胎牛血清的终浓度为10。每批胎牛血清均应进行血清测试，通过测试确定血清的最佳使用浓度。此处提到的血清使用浓度只是一个参考浓度。3. MDCK细胞的传代培养程序此处以T-75细胞瓶单层培养为例，进行叙述。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的浓度必须做相应的调整。用于细胞培养的培养基、EDTA胰酶等，置37预热后，用7075酒精擦拭后放于生物安全柜内。（1） 弃去细胞已生长成片的细胞培养瓶中的培养液，加5mL37预热的EDTA-胰酶；（2） 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均

4、匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA-胰酶；（3） 重新加入5mL37预热的EDTA-胰酶，重复上述步骤；（4） 加1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37孵育细胞瓶直至细胞从细胞瓶的塑料表面分离（约5min10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。加入1mL胎牛血清中和残余胰酶的活性；（5） 加9mL细胞生长液，轻轻移动移液管吹散细胞团，吹打从培养瓶底部一边开始到另一边结束，确保所有底部均被吹打到，吹打时动作要轻柔，尽量避免出现泡沫；（6） 吹打后，瓶中加入90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度约为每mL含105细胞），该培养液含终浓度为10的胎牛血清；（7） 每个T-

5、25细胞培养瓶中加6mL(6105/mL细胞)细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到另一T-75细胞瓶以用于细胞传代的种子。通常6mL细胞悬液23日可长成80%90%的单层细胞片；（8） 于375%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态。注：细胞传代的比例可根据细胞生长状况和实验需要进行调节。消化液除EDTA-胰酶外，也可以用0.25胰酶与Versene按照1:7的比例配成消化液使用。（三）细胞的冻存1. 细胞冻存材料（1） 成片的MDCK细胞：8090成片，细胞生长良好存活率高；（2） 二甲基亚砜（DMSO）；（3） 胎牛血清；（4） EDTA-胰酶(0.05胰酶；0.53mMEDTA4Na)；

6、（5） 无菌移液管：1mL和10mL。（6） 15mL无菌离心管2. 细胞冻存步骤（1） 冻存液的制备：胎牛血清9mL；二甲基亚砜1mL。（2） 细胞消化：消化过程同细胞培养的消化过程。（3） 细胞消化后，移入15mL离心管，1000rpm，离心5min，弃上清，轻弹离心管底，重悬细胞，加入配制好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。细胞冻存浓度为1106/mL细胞。（4） 常规细胞冻存过程：42h，-202h，放入液氮长期保存。如使用商品化冻存盒，直接放于-80过夜，第二天从冻存盒取出，放入液氮保存。（四）细胞的复苏复苏细胞的原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，从而导致细胞死

7、亡。新复苏的细胞一般需要数日或继续传代12代，其细胞生长或细胞特性才会恢复正常。1. 材料（1） 37恒温水浴箱；（2） 细胞生长液；（3） 胎牛血清1mL；（4） T-25培养瓶，无菌移液管；（5） 7075的酒精；（6） 15mL无菌离心管2. 细胞复苏步骤（1） 将细胞生长液放入37水浴预热，预热后以7075的酒精擦拭外壁，放入生物安全柜内；（2） 自液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，避免热胀冷缩过程盖子松掉；（3） 立即放入37水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1min内全部融化，以7075的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜内；在解冻过程中，需做好个人防护，防止冻存管爆裂；（4）

8、取出1.0mL解冻的细胞悬液，缓慢加入到预先加有5mL细胞生长液的15mL离心管内，1000rpm，离心5min，弃去上清，用5mL细胞生长液重悬细胞，移入细胞培养瓶内，放入37 5%CO2培养箱培养。（五）质量控制MDCK细胞随着传代次数的增加，可能会降低其对流感病毒的敏感性。因此实验室应保持低代数的细胞株在液氮中。为了保持该分离系统的敏感性，当细胞复苏后被连续传1520代，或总代数达到40代以上时，可以用已知滴度的阳性质控病毒来检验MDCK细胞系的敏感性。如果细胞的敏感性已经下降，即应复苏新的细胞株。所用细胞系应确保无支原体污染。（六）MDCK细胞系的敏感性的检测选择已知TCID50的流感病毒，在同一条件下分别感染早代（小于30代）的细胞株和现有的细胞株，对其进行TCID50测定。如果测试的TCID50比早代的低2个或以上Lg，表明其对病毒的敏感性已下降，不应继续使用；如果两者相差不超出一个Lg，表明可继续使用。