中药分子鉴定通则第1部分:中药材与中药饮片(T-CACM 010.1—2016).pdf

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1、目摇摇次前言玉1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 方案选择要求15 仪器设备26 试剂和溶液配制27 检验程序28 结果分析和表示29 结果报告310 质量保证311 废弃物处理3附录 A(规范性附录)中药材和中药饮片 DNA 快速提取方法4前摇摇言本标准为中药分子鉴定通则系列标准之一,目前包括以下标准:T/CACM 010郾 12016 中药分子鉴定通则 第 1 部分:中药材与中药饮片T/CACM 010郾 22016 中药分子鉴定通则 第 2 部分:中药提取物与中成药T/CACM 010郾 32016 中药分子鉴定通则 第 3 部分:中药材种子种苗请注意本标准的某些内容有可能

2、涉及专利,本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。本标准的全部技术内容为推荐性。本标准在遵从 中华人民共和国药典 的基础上,提出了 中药分子鉴定通则。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位:中国中医科学院中药资源中心、中国食品药品检定研究院。本标准主要起草人:黄璐琦、袁媛、马双成、蒋超、魏锋、张文娟、郑健、赵玉洋、周骏辉、何雅莉。玉T/CACM 010郾 12016中药分子鉴定通则第 1 部分:中药材和中药饮片1摇 范围本标准规定了使用分子生物学手段鉴定中药材和中药饮片的通用方法和要求。本标准适用于中药材和中药饮片鉴定。2摇 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日

3、期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。中华人民共和国药典GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 236322009 进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3摇 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3郾 1摇DNA 提取 DNA extraction从样品中提取出 DNA 的方法。3郾 2摇DNA 扩增 DNA amplification通过一定技术使一段特定的 DNA 片段拷贝数增加的过程,可通过聚合酶链式反应、环介导等温扩增或

4、其他 DNA 扩增技术实现。3郾 3摇聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction简称 PCR 技术。模板 DNA 先经高温变性为单链,两条引物分别与模板 DNA 两条链上相应的一段互补序列发生退火,在 DNA 聚合酶的作用下,以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使退火引物得以延伸,然后不断重复变性、退火和延伸这一循环,使位于两段已知序列之间的 DNA 片段拷贝数呈几何倍数增长。其扩增产物可通过多种特异性和敏感性好的方法进行检测。3郾 4摇阳性对照 Positive control一般使用对照药材代替送检样品同法 DNA 提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用于证明鉴定过程

5、可获得目标核酸片段的操作。3郾 5摇阴性对照 Negative control使用常见伪品药材代替送检样品同法 DNA 提取、靶核酸扩增和产物检测过程。3郾 6摇空白对照 Blank control以水代替送检样品同法 DNA 提取、靶核酸扩增和产物检测过程,用以证明提取过程中没有核酸污染。4摇 方案选择要求中药材和中药饮片分子鉴定应采用抽取有代表性的送检样品与对照药材进行比较的验证方式,包1T/CACM 010郾 12016含 3 个基本步骤:模板 DNA 的提取,目标序列/信号的扩增,结果检测与判定。并根据检测目的不同要求,遵循准确、简便、快速原则选择适宜的 DNA 提取、扩增和检测方案。

6、每次鉴定实验均应包含阳性对照、阴性对照和空白对照。5摇 仪器设备所有制备样品使用的器具在使用前应灭菌处理。根据方案,写出标准中需要说明的仪器设备。6摇 试剂和溶液配制试剂配制所用水应符合 GB/T 66822008 规定的一级水要求。试剂应为不含 DNA 和 DNase 的分析纯或生化试剂。试剂的保存应有防污染措施。试剂配制操作应在单独的制备区进行。所配制的溶液均须高压灭菌保存,不宜高压灭菌的试剂应使用超滤设备(孔径 0郾 22滋m)除菌。应记述鉴别引物的名称和序列、合成引物质量要求、纯化方式等。无特殊说明时,所有的酶应在-20益保存,使用时应在冰上操作。7摇 检验程序7郾 1摇 检查注意事项

7、根据检测目的不同要求,选择适宜的 DNA 提取、扩增和检测程序。为防止交叉污染,收样、取样、粉碎、DNA 提取、核酸扩增和产物检测应在不同操作间或在同一操作间不同隔离区域进行,进入各区域应严格按照单一方向进行,即样品制备区寅核酸制备区寅扩增区寅检测区。7郾 2摇 取样取样应在样品制备区进行。送检样品、试样的抽取、分取应有代表性。应根据送检样品的不同要求,确定样品数量或重量。送检样品抽样方法参照 中国药典 药材和饮片取样法(通则 0211)。送检样品取样部位根据不同样品特性应有不同处理方式。为防止外源污染,应去除中药材和中药饮片表面附着物,依次使用 75%乙醇和无菌双蒸水擦拭表面后晾干,或采取其

8、他有效去除外源污染的方法。7郾 3摇 粉碎粉碎应在样品制备区进行。取送检样品置乳钵、组织匀浆机或球磨粉碎仪中充分研磨,必要时加适量液氮研磨。进行样品前处理时应有预防交叉污染的措施,以避免送检样品交叉污染而导致假阳性结果的出现。7郾 4摇 DNA 提取DNA 提取应在核酸制备区进行。应根据送检样品特性选择合适的 DNA 提取方法或用等效 DNA提取试剂盒进行 DNA 提取,所提取的 DNA 应符合扩增的要求,模板 DNA 必要时可进行适当的稀释或浓缩。7郾 5摇 核酸扩增扩增应在扩增区进行。核酸扩增反应体系总体积可依据中药材和中药饮片种类及其所使用方法确定。应根据核酸扩增仪型号、酶、引物等选择适

9、宜的反应程序。扩增产物于 4益保存。应记述鉴别引物的预期扩增片段长度范围、条带数目等信息。7郾 6摇 扩增产物检测扩增产物检测应在检测区进行。根据检测方案,选择合适的扩增产物检测方法,包括琼脂糖凝胶电泳、核酸序列测定、荧光检测、荧光定量 PCR、基因芯片分析等。8摇 结果分析和表示8郾 1摇 特异性 PCR8郾 1郾 1摇 凝胶电泳法在阴性对照、阳性对照和空白对照结果均符合规定的情况下,若送检样品出现预期数目和大小的特征条带,则判定测试结果为阳性;若送检样品未出现预期数目和大小的特征条带,则判定为阴性。2T/CACM 010郾 120168郾 1郾 2摇 荧光检测法在阴性对照、阳性对照和空白对

10、照结果均符合规定的情况下,若送检样品与阳性对照一致,则判定测试结果为阳性,否则为阴性。8郾 2摇 荧光定量 PCR 法在阴性对照、阳性对照和空白对照结果均符合规定的情况下,根据荧光定量 PCR 的 Ct 值进行判定,若送检样品 Ct 值与阳性对照 Ct 值位于同一设定范围内为阳性,与阴性对照 Ct 值位于同一设定范围内为阴性,Ct 值介于阳性对照 Ct 值与阴性对照 Ct 值之间为可疑阳性,可疑阳性样品需进行重复试验或采用其他方法验证。8郾 3摇 基因芯片在阴性对照、阳性对照和空白对照结果均符合规定的情况下,如送检样品信噪比与阳性对照信噪比位于同一设定范围内为阳性,与阴性对照信噪比位于同一设定

11、范围内为阴性,信噪比介于阳性对照与阴性对照之间为可疑阳性,可疑阳性需重复试验或采用其他方法验证。8郾 4摇 核酸序列测定和分析扩增产物经适当纯化、浓缩后使用 DNA 测序仪双向测序,将拼接获得序列与阳性对照序列进行比对,依据二者序列相似度和谱系关系原则判定。8郾 5摇 其他方法应根据选择方法的技术原理要求和品种实际需求建立结果分析和表示方法。9摇 结果报告9郾 1摇 一般要求定性检测结果应表示为阳性“+冶 或阴性“-冶;定量检测结果应符合具体品种分子鉴定标准。9郾 2摇 鉴定报告样品经检测后,根据具体操作程序和结果做好详细的实验记录,出具检测报告。检测报告至少包含以下内容:送检样品的名称、状态

12、和明确的标识;检测依据;取样方法与日期;储存条件;检测开始和结束日期;检测负责人和实验人员;阴性对照、阳性对照、送检样品;特定方法取得的结果,结果使用的单位及计算方法;检测结论;检测过程观察到的特别情况;其他需要报告的内容。10摇 质量保证检测结果应来自两份送检样品。当一份送检样品的结果为阳性,另一份为阴性时,需重新测试。可以适当增加核酸扩增反应体系中 DNA 模板浓度,使两份送检样品得到同样的结果。如果经过两次以上从核酸提取开始的重复检测,检测结果均不一致,可在检测报告中注明检测低限。定性方法的检测低限应符合最低含量水平。11摇 废弃物处理检测过程中的废弃物,应参照 GB/T 2740320

13、08 进行处理。有毒有害废弃物应经过除害处理,处理要符合环保要求。3T/CACM 010郾 12016附录 A(规范性附录)中药材和中药饮片 DNA 快速提取方法A郾 1摇 范围本方法适用于从动植物类中药材和中药饮片中快速提取 DNA。检测时应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。A郾 2摇 原理碱裂解法:当中药材和中药饮片粉末在 0郾 2 1郾 0mol/L 的 NaOH 溶液中裂解时,蛋白质与 DNA发生变性,当加入中和缓冲液后,DNA 分子能够迅速复性,呈溶解状态存留于上清液中。A郾 3摇 试剂和材料DNA 提取缓冲液:0郾 5mol/L NaOH、1%PVP、1%Triton X-100;

14、中和缓冲液:0郾 1mol/L Tris-HCl(pH 8郾 0)。A郾 4摇 仪器离心机、微量移液器(量程应覆盖所需的使用范围)、电子天平A郾 5摇 DNA 快速提取A郾 5郾 1摇 常量 DNA 提取取 10 25mg 干燥中药材和中药饮片粉末置 2郾 0mL 离心管,加入 200滋L DNA 提取缓冲液,漩涡震荡 1min 充分混匀。加入 800滋L 中和缓冲液,充分混匀;12000r/min 离心 1min 或静置 5min,转移500滋L 上清液至一新离心管内,加入 500 滋L 中和缓冲液,混匀;12000r/min 离心 1min 或静置 5min。上清液可作为总 DNA 模板,4益临时保存或-20益长期保存。A郾 5郾 2摇 微量 DNA 提取取 96 孔微孔板,每一孔内加入约 1mg 中药材和中药饮片粉末及 20滋L DNA 提取缓冲液,充分混匀,煮沸 10 15s,取出后充分混匀。每一孔内加入 80滋L 中和缓冲液,混匀。300r/min 下离心 5min或静置 15min。取 5滋L 上清加入 75滋L 去离子水中。300r/min 下离心 1min 或静置 5min。上清液可作为总 DNA 模板,4益临时保存或-20益长期保存。注:DNA 提取和纯化过程应设置空白对照。4