【生物课件】动物细胞融合技术与单克隆抗体课件 高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

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1、第第2 2课时课时动物细胞融合技术与单克隆抗体动物细胞融合技术与单克隆抗体Animal cell fusion technique with monoclonal antibodies动物细胞工程动物细胞工程ONEONE1 1动物细胞融合技术动物细胞融合技术W H E N C O B W E B S R U T H L E S S LY S E I Z E D1.概念：概念：2.结果：结果：动物细胞融合也称动物细胞融合也称细胞杂交细胞杂交，是指，是指两个或多个动物细胞两个或多个动物细胞形成形成一个细胞一个细胞的过程。的过程。形成的具有原来形成的具有原来 的的 细胞，细胞，称为称为 。3.原理：

2、原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性 动物细胞融合技术动物细胞融合技术单核单核两个或多个细胞遗传信息两个或多个细胞遗传信息杂交细胞杂交细胞4.动物细胞融合的方法动物细胞融合的方法：与植物原生质体与植物原生质体融合的方法相同融合的方法相同物理方法：物理方法：动物细胞没有细胞壁，可以直接诱导融合。动物细胞没有细胞壁，可以直接诱导融合。电融合法、离心法电融合法、离心法化学方法：化学方法：聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法生物方法：生物方法：灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法灭活是指用物理或化学手段灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失使病毒或细菌失去感染能力去感染能力，并不破坏它们的抗原结构并不破坏它们的抗

3、原结构。动物细胞融合动物细胞融合特有特有动物细胞融合技术动物细胞融合技术动物细胞融合技术动物细胞融合技术原理原理 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够能够与细胞膜上的糖蛋白发与细胞膜上的糖蛋白发生作用生作用，使细胞相互，使细胞相互凝集凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布重新排布，细胞膜打开细胞膜打开，细胞发生，细胞发生融合融合。动物细胞融合技术动物细胞融合技术5.5.构建动物细胞融合模型构建动物细胞融合模型：融合过程融合过程:细胞膜融合细胞膜融合细胞质融合细胞质融合 _ _融合。融合。重组细胞的特点重组细胞的特点:具有具有_,_,

4、杂种细胞表现出杂种细胞表现出两个两个_的特点。的特点。融合后的杂交细胞经过融合后的杂交细胞经过_后仍能形成两个完整的杂交后仍能形成两个完整的杂交细胞。细胞。动物细胞动物细胞A A 动物细胞动物细胞B B 膜融合、质融合膜融合、质融合动物细胞动物细胞培养培养杂交细胞（单核）杂交细胞（单核）物理、化学、物理、化学、生物法诱导生物法诱导细胞核细胞核亲本细胞亲本细胞有丝分裂有丝分裂两种细胞的遗传信息两种细胞的遗传信息动物细胞融合实质及完成的标志动物细胞融合实质及完成的标志动物细胞融合技术动物细胞融合技术6.意义意义：7.应用：应用：突破了有性杂交方法的局限，使突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交远缘杂

5、交（种间、属间、（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。科间、动植物之间）成为可能。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体杂交瘤技术制造单克隆抗体。动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术的比较动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术的比较植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合原理原理细胞融合细胞融合前的处理前的处理方法方法诱导细胞诱导细胞融合的方融合的方法法细胞膜具有一定的流动性细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动细

6、胞膜具有一定的流动性性用果胶酶和纤维素酶去除细用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散使细胞分散成单个细胞成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二电融合法、离心法；聚乙二醇（醇（PEGPEG）融合法、高）融合法、高CaCa2+2+-高高pHpH融合法融合法PEGPEG融合法、电融合融合法、电融合法、灭活病毒诱导法法、灭活病毒诱导法动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术的比较动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术的比较植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合细胞融合成功的标成功的标志志主要主要用途用途意义意义再生出细胞壁再生出细胞壁细胞核的

7、融合细胞核的融合获得完整的杂种植株获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物缘杂交育种，培育植物新品种新品种突破了有性杂交的局限，使突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能远缘杂交成为可能TWOTWO2 2单克隆抗体及其应用单克隆抗体及其应用早期获得抗体的方法早期获得抗体的方法 向动物体内反复向动物体内反复注射注射某种某种抗原抗原，使动物，使动物产生抗体产生抗体，然后从动，然后从动物血清中物血清中分离分离所需抗体。所需抗体。产量低，纯度低，制备的抗体特异性差、产量低，纯度低，制备的抗体特异性差、反应不灵敏反应不灵敏

8、反复反复注射注射动物体内动物体内抗原抗原 多种浆细胞多种浆细胞多种多种抗体（血清）抗体（血清）每一个浆细胞只能产生一种每一个浆细胞只能产生一种特异性抗体特异性抗体体内产生的特异性抗体体内产生的特异性抗体多达百万种多达百万种缺点缺点 动物会接触多种天然抗原，体内相应产生的特异性抗体种类动物会接触多种天然抗原，体内相应产生的特异性抗体种类可以达到百万种以上，但每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗可以达到百万种以上，但每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的淋巴细必须克隆单一的淋巴细胞，形成细胞群。胞，形成细胞群。遗憾的是，在体外

9、培养条件下，遗憾的是，在体外培养条件下，一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞是是不可能不可能无限增殖无限增殖的。的。在体外培养条件下，如何让一个在体外培养条件下，如何让一个B B淋巴细胞无限淋巴细胞无限增殖？增殖？一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞B B淋巴细胞群淋巴细胞群单克隆抗体单克隆抗体克隆克隆产生产生为什么为什么B B淋巴细胞能不能无限增殖？淋巴细胞能不能无限增殖？单个单个B B淋巴细胞淋巴细胞寿命有限，又因为能产生抗体的寿命有限，又因为能产生抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞属于高度分化的细胞，不能无限繁殖不可能无限增殖。属于高度分化的细胞，不能无限繁殖不可能无限增殖。19751975年，英国科学家

10、米尔斯坦和德国科学家科勒设计了年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：一个极富创造性的试验方案：解决解决米尔斯坦米尔斯坦【英国】【英国】科勒科勒【德国】【德国】把一种把一种B B淋巴细胞与能在体外大量增殖淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞就能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。就能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。基本思路基本思路一种一种B B淋巴细胞淋巴细胞（只产生一种特定抗体）（只产生一种特定抗体）能在体外大量增殖的能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合融合杂交瘤细胞杂交瘤细胞产生足够数量产

11、生足够数量的特定抗体的特定抗体大量大量增殖增殖单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体：单克隆抗体：由单个由单个B B淋巴细胞经过克隆（无限增殖），形成淋巴细胞经过克隆（无限增殖），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。异性强的抗体。既能迅速大量增殖，既能迅速大量增殖，又能产生抗体又能产生抗体单单克克 隆隆抗抗 体体一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞 细胞群细胞群抗体抗体克隆克隆制备过程制备过程用特定的抗原免疫，从用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能小鼠的脾中得到能产生产生特定抗体的特定抗体的B B淋巴细胞。淋巴细胞。培

12、养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞多种多种B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞诱导融合诱导融合将骨髓瘤细胞与将骨髓瘤细胞与B B淋巴细胞融合淋巴细胞融合多种杂交细胞多种杂交细胞BB BB、B B瘤瘤 、瘤瘤、瘤瘤 *不是为了得到抗体！不是为了得到抗体！制备过程制备过程 对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆克隆化培养化培养和和抗体检测抗体检测，经多次筛选，就可获得足，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。够数量的能分泌所需抗体的细胞。抗体检测呈阳性的抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞分泌的抗体能与分泌的抗体能与特定抗原结合特定抗原

13、结合制备过程制备过程抗体检测呈阳性抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞体外培养体外培养注射到小鼠腹腔内注射到小鼠腹腔内 将抗体检测呈阳性的杂交瘤细将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。注射到小鼠腹腔内增殖。单克隆抗体单克隆抗体从细胞培养液或小鼠腹水从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。中获取大量的单克隆抗体。细胞细胞培养液培养液提取提取小鼠小鼠腹水中腹水中提取提取项目项目第一次筛选第一次筛选第二次筛选（需要多次筛选）第二次筛选（需要多次筛选）筛选原因筛选原因方法方法筛选结果筛选结果诱导融合后得到多种杂诱导融合后得到多种

14、杂交细胞，还有未融合细交细胞，还有未融合细胞等胞等用特定的选择培养基进行筛用特定的选择培养基进行筛选：未融合的亲本细胞和融选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。才能生长。筛选获得多种杂交瘤筛选获得多种杂交瘤细胞细胞选择培养获得的杂交瘤细胞中选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。有能产生其他抗体的细胞。用用96孔板培养，在每个孔中尽量接种孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到培养和抗体检测，经过多次筛选得到足

15、够数量的能分泌所需抗体的细胞。足够数量的能分泌所需抗体的细胞。筛选出分泌所需抗体的杂筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞交瘤细胞项目项目腹腔培养腹腔培养体外培养体外培养优点优点缺点缺点易于控制培养条件易于控制培养条件（如无需提（如无需提供无菌环境等），操作简单，供无菌环境等），操作简单，成本较低成本较低规模小，产量少规模小，产量少可大规模培养，大量可大规模培养，大量生产生产需要人为控制培养条需要人为控制培养条件，成本相对较高件，成本相对较高制备过程制备过程单克隆抗体单克隆抗体筛选二筛选二杂交细胞杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞体外或体内培养体外或体内培养筛选一筛选一骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 诱导融合诱导融合

16、分泌特异抗体的杂交瘤细胞分泌特异抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞群杂交瘤细胞群提取提取已免疫的已免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞动物细胞动物细胞融合技术融合技术动物细胞动物细胞培养技术培养技术既能大量繁殖既能大量繁殖又能产生专一又能产生专一抗体抗体特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高可大量制备可大量制备注射抗原注射抗原细胞增殖细胞增殖细胞膜具有流动性细胞膜具有流动性单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备(1)(1)该过程中应用到的该过程中应用到的技术：技术：(2)(2)原理：原理：(3)(3)注射特定抗原的注射特定抗原的目的：目的：(4)(4)诱导融合的诱导融合的方法：方法：动物动物细胞特有的为细胞特有的为_动物

17、细胞融合、动物细胞培养动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的到能产生特定抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞PEGPEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备(5)(5)比较两次筛选的不同：比较两次筛选的不同：(6)(6)杂交瘤细胞的杂交瘤细胞的特点：特点：(7)(7)如何获取大量所需如何获取大量所需杂交瘤细胞杂交瘤细胞？(8)(8)如何获取单克隆抗体：如何

18、获取单克隆抗体：既能迅速大量繁殖，又能产生抗体既能迅速大量繁殖，又能产生抗体在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取或从小鼠腹水中获取从细胞培养液中获取或从小鼠腹水中获取第一次筛选：获得多种杂交瘤细胞第一次筛选：获得多种杂交瘤细胞第二次筛选：获得分泌特定抗体的杂交瘤细胞第二次筛选：获得分泌特定抗体的杂交瘤细胞优点优点(1)(1)能准确地识别抗原的细微差异能准确地识别抗原的细微差异;(2)(2)与特定抗原发生特异性结合与特定抗原发生特异性结合;(3)(3)可以大量制备。可以大量制备。资料资料1 1 用用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体抗人绒毛膜促性腺激素单

19、克隆抗体做成的做成的“早早孕诊早早孕诊断试剂盒断试剂盒”，在妊娠第，在妊娠第8 8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了法提前了10d10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%90%以上。以上。女性怀孕后会分泌一种糖蛋白女性怀孕后会分泌一种糖蛋白人人绒毛膜促性腺激素绒毛膜促性腺激素（HCGHCG），尿液中会检出），尿液中会检出HCGHCG的的存在。用抗存在。用抗HCGHCG单克隆抗体制备单克隆抗体制备的试纸可

20、以测试女性是否怀孕。的试纸可以测试女性是否怀孕。作为诊断试剂作为诊断试剂 (最广泛的用途最广泛的用途)应用应用资料资料2 2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体一药物抗体一药物偶联物偶联物（antibody-drugconjugate,ADCantibody-drugconjugate,ADC）通过将细胞毒素与能特通过将细胞毒素与能特异

21、性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。择性杀伤。ADCADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，分组成，它的作用机制如下图所示。它的作用机制如下图所示。单克隆抗体单克隆抗体+接头接头+药物（如细胞毒素）药物（如细胞毒素）=ADCADC用于疾病的治疗和运载药物用于疾病的治疗和运载药物 (主要用于癌症的治疗主要用于癌症的治疗)单克隆抗体：单克隆抗体：(1 1).特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 生物导弹生物导弹单抗单抗抗癌药物抗癌药物 原理：原理：(2 2).疗效高

22、、毒副作用小疗效高、毒副作用小 ：不损伤正常细胞不损伤正常细胞 ，减少剂量，减少剂量导向作用导向作用，将药物定向带到，将药物定向带到癌细胞所在位置癌细胞所在位置抗癌药物：抗癌药物：杀死杀死癌细胞癌细胞概述应用动物细胞融合技术过程结果意义原理融合方法原理应用单克隆抗体的制备免疫处理第一次筛选诱导融合第二次筛选大规模培养诊断试剂运载药物治疗疾病克隆化培养抗体检测体外培养小鼠腹腔FOURFOUR4 4课后作业课后作业H O M E W O R K A F T E R C L A S S1 1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的

23、是是()A.A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.B.都可以用电融合法或都可以用电融合法或PEGPEG融合法诱导融合融合法诱导融合C.C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株C C2.2.科学家以科学家以SARSSARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的克隆抗体。下列相关叙述正确的是是()A.A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染利用该单克隆抗体可以诊断是

24、否感染SARSSARS病毒病毒B.B.体外培养单个体外培养单个B B淋巴细胞可以获得针对淋巴细胞可以获得针对SARSSARS病毒的单克病毒的单克隆抗体隆抗体C.C.将等量将等量B B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞细胞即为杂交瘤细胞D.D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体中分离出的抗体为单克隆抗体A A 3 3、假如、假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思

25、路是怎样的？这样做会决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流字报告，与同学交流。可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。一些伦理方面的问题。-FORVIEWING-THANK-YOUTHANK-YOU