基本实验技术课件 .ppt

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1、.1基本实验技术.2内容提要 一、基本实验技术和方法 细胞培养 MTT 划痕修复 western blot siRNA 二、如何把实验做好（心得体会）.3一、基本实验技术和方法（一）细胞培养 1 培养细胞的特性 培养细胞的生长方式 贴附生长：贴附于支持物表面 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长.4游离期 贴壁期.5.6潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）.7培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要（血清质量好坏是实验成败的关键）2 细胞的生存环境 温度:37 O2 20%CO2:5%CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-pH:7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒.82.四唑盐（MTT）比

2、色法 原理：（1）活细胞 线粒体 脱氢酶（2）可溶性的四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。.9预实验 OD:0.81.2 有效值（线性范围）吸光度与所含的formazan量成正比细胞点板量的确定（保证所测的con值在0.8-1.2 之间）不同的细胞株不同不同的时间点不同.10每孔细胞量 24 h 48 h3000 0.4 0.55000 0.6 0.78000 0.8 0.910000 1 112000 1.1 1.115000 1.2 1.220000 1.3 1.4.11细胞计数104 个/ml每孔点板 100 l 给药 100 l.1

3、2 操作步骤（1）单细胞悬液接种于96 孔培养板；8000 个细胞/孔，每孔培养基总量200 微升（100+100），37、5 CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2 毫克毫升的MTT 液（20 微升孔）；继续培养3 小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（100 微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570 nM）。记录结果，绘制.13点板注意事项 蛇行点板 十字交叉给药方向点板方向.14 直接比较各组OD值 计算抑制率，公式（对照-本底）-（给药-本底）/（对照-本底）*100%.153.划痕修

4、复实验（wound healing）原理：肿瘤细胞运动特性之一：侧向迁移能力 借鉴体外细胞至伤愈合模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后观察处理后细胞迁移的能力0 h24 hCon(10%血清)给药.16实验步骤 1.细胞点板，具体数量因细胞不同而不同，并根据给药时间和条件来定。2.第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不要倾斜。3.用PBS 洗细胞3 次，去除划落的细胞，加入培养基。4.放入37 5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24 小时取样，拍照。.17实验要点 划痕质量 宽度 笔直程度划痕后一定要清洗干净.18结果处理Part 1Part 2.194.W

5、estern blot 原理：经过电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体 抗原抗体反应 先分离后分析蛋白含量或者表达、存在形式的变化.20 蛋白样品的制备 SDS 聚丙烯酰胺 凝胶电泳l 转膜l 封闭l 一抗杂交l 二抗杂交l 底物显色实验步骤.21实验要点 1.上样量 蛋白KD 数 2.制胶：上层胶和下层胶的比例 上层胶不能有碎胶 泳道笔直 3.加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象 4.转膜：成功的关键 保证时间 不同厚度的胶最好不要一起转.22 5.合适一抗浓度 低：没有条带或条带不清晰高：非特异性结合 杂带 6.样品缓冲液中煮沸的样品可在-20 存放数月,但

6、是反复冻融会使蛋白质降解.235.siRNA 原理 dsRNA的剪切 RISC的形成 siRNA介导的RISC 对mRNA的剪切作用.24RISC（RNA-induced silencing complex）.25 选择、设计、合成siRNA双链（5种）化学合成siRNA 质粒表达siRNA 转染siRNA到靶细胞 瞬时表达 化学合成siRNA，质粒表达siRNA 稳定表达 质粒表达siRNA 分析检测RNA干扰作用 蛋白水平:WB/IF/FC mRNA水平:RT-PCR、northern blotting siRNA基因沉默实验设计.26siRNA转染方法 磷酸钙共沉淀 DEAE-葡聚糖和p

7、olybrene 电穿孔法 机械法 阳离子脂质体试剂 阳离子聚合物 病毒介导法.27DNA or siRNA:highly anionic and hydrophilic macromoleculeNo ionic interaction+Cationic macromolecule+Cationic ReagentMembrane:anionic and hydrophobic-.28siRNA转染试剂 Lipofectamine 2000（Invitrogen）INTERFERin（Polyplus）Oligofectamine（Invitrogen）HiPerFect（Qiagen）Si

8、LentFect（BioRad）.29转染的检测 蛋白水平检测 蛋白水平检测:WB/IF/FC WB/IF/FCmRNAmRNA水平检测水平检测:RT-PCRRT-PCR、northern blottingnorthern blotting.30步骤.31.32.33.34注意事项 避免RNA酶污染 细胞状态 培养基和严格的操作确保转染的重复性 避免使用抗生素 根据转染试剂对细胞的毒性调整转染时间.35二、如何把实验做好（心得体会）（一）准备工作 熟悉实验方法（熟记于心）提前一天准备实验用品（细胞、试剂、耗材、实验仪器）（二）规范的操作（三）不要想当然的解决问题（四）及时沟通分析失败的原因（五）准时处理结果个人观点供参考，欢迎讨论！