【课件】2023届高三生物一轮复习课件：基因工程的基本操作程序.pptx

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1、基因工程1.目的基因的获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定获取目的基因的常用方法：1.从基因文库中获取目的基因2.人工合成目的基因基因表达载体的组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因植物细胞：农杆菌转化法(常用）、基因枪法、花粉管通道法动物细胞（受精卵）：显微注射法微生物细胞：感受态细胞法检测方法：1.分子水平：DNA分子杂交法、分子杂交法、抗原抗体杂交法2.个体水平：抗虫鉴定抗病鉴定、活性鉴定等三.基因工程的基本操作程序原核细胞的基因结构非编码区 非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子 终止子不编码蛋白质编码蛋白质编码区（编码

2、序列）非编码区（非编码序列）原核细胞基因结构调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等复习：三.基因工程的基本操作程序编码区编码区非编码区 非编码区非编码区非编码区DNA聚合酶有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子 启动子 终止子基因(以真核生物的逆转录过程为例)逆(反)转录法以mRNA为模板,反转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子。(目的基因)复习：三.基因工程的基本操作程序（1）目的基因指：主要是；也可以是；例如与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因等（2）获取目的基因的常用方法：编码蛋白质的基因 具有调控作用的因子获

3、取方法从基因文库中获得利用PCR技术扩增人工合成法A.逆转录法B.化学合成法三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取(1)从基因文库中获取目的基因基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因文库的种类:。基因组文库：部分基因文库：含有一种生物的全部基因只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库基因组文库和部分基因文库三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取文库类型 cDNA文库 基因组文库文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）基因多少物种间的基因交

4、流小 大无 有无 有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以基因组DNA文库与cDNA文库的比较三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取基因文库的种类:。基因组文库和部分基因文库(2)人工合成法：逆转录法：即以作为模板，在酶的作用下合成，若要运用该方法获得人的胰岛素基因，则只能从人的细胞中提取到胰岛素的mRNA进行逆转录获取胰岛素基因；原因是。上述方法获得的胰岛素基因（cDNA）在基因结构的特点是。mRNA 逆转录cDNA胰岛B胰岛素基因只会在胰岛B细胞中表达，其他细胞中不表达基因只包括了编码区中的外显子序列，而没有非编码区和内含子序列三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的获

5、取(2)人工合成法：化学合成法基因比较小且目的基因的核苷酸序列已知，可通过（填仪器）用直接人工合成A.蛋白质工程运用化学合成法合成目的基因的基本途径是.B.若是控制同一种蛋白质合成的目的基因，利用化学合成法合成的基因可能有（一种/多种）；理由是。DNA合成仪化学方法预期蛋白质的功能设计预期蛋白质结构推测应有氨基酸序列找到对应的脱氧核苷酸序列遗传密码具有简并性或一种氨基酸可能由多个密码子决定多种三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取(2)人工合成法：化学合成法（能/不能）合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类的要求【易错积累】从基因组文库中获得的胰岛素基因（含内含子），若以

6、大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是。能胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取(3)利用PCR技术扩增目的基因概念：PCR全称为，是一项在生物（体内/体外）复制特定DNA片段核酸合成技术原理：。前提：要有一段，以便根据这一序列合成。引物的化学本质：是一小段；它是以为模板，在酶的作用下合成的聚合酶链式反应 体外DNA半保留复制已知目的基因的核苷酸序列引物DNA或RNA单链DNA单链引物【思考】合成引物时是否需要知道目的基因的所有的碱基序列？三.基因工程的基本操作程序1.目

7、的基因的获取两种引物的要求：。引物自身不能环化两种引物之间不能互补配对引物长度不宜过短，防止引物随机结合(3)利用PCR技术扩增目的基因三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取例.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。(1）第1组：；（2）第2组：。引物和引物局部发生碱基互补配对而失效引物自身内部部分碱基发生互补配对而失效三.基因工程的基本操作程序A.模板DNA：；B.分别与两条模板链相结合的种引物；C.原料：；D.酶：；E.控制温度（由控制）、PH值（由调节），但不需解旋酶。DNA的两条链两四种脱氧核苷酸Taq酶

8、（耐高温的DNA聚合酶）PCR扩增仪缓冲液循环过程(3)利用PCR技术扩增目的基因三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取循环过程变性模板DNA加热至900C以上时，模板DNA双链解聚为单链。复性温度下降到50左右，两种引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。延伸温度上升到72，在Taq酶的作用下，以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则，合成一条新的DNA链(3)利用PCR技术扩增目的基因三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取PCR反应的实验操作A.按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）B.用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）C.盖严离心管口的盖子，

9、用手指轻轻弹击管壁（混合）D.将微量离心管放在离心机上（离心）E.将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数 循环数 变性 变性 复性 复性 延伸 延伸预变性 预变性 94C,94C,5 5min min 30 30次 次 4 4，30s 30s 55 55，30s 30s 72 72，1min 1min最后一次 最后一次 4 4，1min 1min 55 55，30s 30s 72 72，1min 1min(3)利用PCR技术扩增目的基因三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取总结：PCR技术和DNA复制的比较三.基因工程的基本操作程序PCR扩增过程中的循环图示与规律

10、循环过程(3)利用PCR技术扩增目的基因三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取A.上一次循环的产物为下一循环的模板C.处于两引物之间的DNA序列呈指数增长B.有最初母链的两个DNA分子只含一个引物，其它子代DNA分子都为两个引物分子【归纳总结】（1)PCR技术扩增时需要适宜的温度和PH值，温度可以由自动调控，PH值由来调节。（2）DNA聚合酶只能特异性地复制处于之间的DNA序列,使其成指数倍增加（3）若一个DNA分子利用PCR扩增N次后，产生的2N个DNA分子，其中有个DNA分子只含有一个引物，个DNA分子中每个DNA分子都含有两种引物（4）通过N次复制产生的子代DNA分子中含有（如引物

11、I或引物II）的DNA分子占DNA分子总数的比为。（5）第轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，占所得DNA分子的比例为。（2N-1）/2N两个引物PCR扩增仪缓冲液232N-21/4三.基因工程的基本操作程序例8.如图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向例9.若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是。引物甲、引物丙三.基因工程的基本操作程序第_代出现完整的目的基因n代后，含引物的DNA分子有_个n代后，共消耗_个引物n代后，完整的目的基因有_个32n2n+1-22n-2n（3）利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入两

12、种引物，原因是，在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是。DNA聚合酶只能特异地复制处于之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了轮的DNA复制。(4)目的基因能被准确扩增的原因是。DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增两个引物从子链的5端向3端延伸5目的基因独特的双螺旋结构提供了精确的复制模板；碱基互补配对原则保证复制准确的进行(2n+1-2)=62三.基因工程的基本操作程序（5）从理论上讲，在PCR技术中，循环4次产生的DNA分子中，第四次循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为。（6）假设DNA片段有150个脱氧核苷酸对，若D

13、NA分子中胞嘧啶脱氧核苷酸有70个，则5次循环，需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸个（不考虑引物所对应的片段）（7）假设DNA片段有200个脱氧核苷酸对，经3次扩增后，从理论上计算，除需要引物14个外（注：每个引物中含有20个脱氧核苷酸），还需要游离的脱氧核苷酸个。15/1624802520(2n-1)T(2n-1)400-2014(2n+1-2)=14三.基因工程的基本操作程序（9）用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物、，其连接部位如下图所示，X为某限制酶识别序列。扩增得到的绝大部分DNA片段是图A-D中的（）D三.基因工程的基本操作程序（1）构建目的：；。（2）构建过程：2.基因表

14、达载体的构建基因工程的核心：同种限制酶如果使用两种限制酶同时切割目的基因和质粒，有何优点?。若只考虑两两连接，质粒和目的基因至少可以连接种；即。可防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因与运载体的反向连接3目的基因-目的基因、质粒-质粒、目的基因-质粒使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代。使目的基因能够表达和发挥作用三.基因工程的基本操作程序（3）基因表达载体的组成及作用：目的基因：能控制表达所需要的特殊性状。启动子作用：。终止子：使终止的特殊结构的DNA片段。标记基因：种类：。作用：。复制原点：。转录四环素抗性基因，卡那霉素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因等抗生素抗性基因用于鉴别和

15、筛选含有目的基因的受体细胞DNA分子复制的起点启动子具有物种和组织特异性。即只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。如：构建在水稻胚乳细胞内表达的表达载体需要选择的启动子是。水稻胚乳细胞启动子是RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA2.基因表达载体的构建基因工程的核心：三.基因工程的基本操作程序(1)转化：指。(2)常用的受体细胞：原核生物：。真核生物：。(3)将目的基因导入受体细胞的原理：。(4)常用的方法：植物细胞：。动物细胞：。微生物细胞：。酵母菌和动植物细胞等借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径大肠杆菌枯草杆菌土壤农杆菌等农杆菌转化法显微注射法感受体细胞法目的基因

16、进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程3.将目的基因导入受体细胞：三.基因工程的基本操作程序A.农杆菌转化法农杆菌特点：易感染植物，对大多数植物没有感染能力。原理：Ti质粒上的可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。【易错积累】a.农杆菌的作用是。b.用农杆菌感染时，优先选择（受伤的/完好的）叶片与重组质粒的农杆菌培养，选用该叶片的理由是。双子叶植物和裸子 单子叶T-DNA感染植物细胞，把目的基因插入到植物细胞的染色体的DNA上受伤的叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌3.将目的基因导入受体细胞：三.基因工程的基本操作程序c.若要利用农杆菌转化法转化单

17、子叶植物细胞，可采取添加，其目的是。d.利用Ti质粒构建重组质粒的目的是：。酚类物质吸引农杆菌移向受体细胞，有利于目的基因成功转化将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA上，利用其将目的基因导入受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上，使目的基因的遗传特性稳定维持和表达A.农杆菌转化法3.将目的基因导入受体细胞：三.基因工程的基本操作程序农杆菌转化法过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入 植物细胞染色DNA表达新性状导入农杆菌A.农杆菌转化法3.将目的基因导入受体细胞：三.基因工程的基本操作程序B.在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入

18、胚囊。如A.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；花粉管通道法我国科学家独创的将Bt 基因导入棉花细胞的方法2.转化的受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞C.实例:将Bt基因导入棉花细胞三.将目的基因导入受体细胞方法:。受体细胞：。显微注射技术受精卵B.将目的基因导入动物细胞【思维拓展】为什么受体细胞选受精卵而不是正常体细胞？。受精卵具有全能性且体积大,易操作；而动物体细胞的全能性受限3.将目的基因导入受体细胞：三.基因工程的基本操作程序提纯含目的基因表达载体取卵显微注射受精卵发育受精卵移植到子宫新性状动物早期胚胎过程：B.将目的基因导入动物细胞3.将目的基因导入受体细胞：三.基

19、因工程的基本操作程序C.将目的基因导入微生物细胞常用法:.常用菌：。微生物作为受体细胞的原因是。过程：Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNACa2+处理法(感受态细胞法)大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少受体细胞用Ca2+处理的目的是。用Ca2+处理受体细胞是通过改变的通透性来完成使其变为感受态细胞，容易吸收周围环境中的DNA分子细胞膜3.将目的基因导入受体细胞：三.基因工程的基本操作程序(1)检测和鉴定，它是目的基因能否在个体内稳定遗传的关键，采用的技术是。是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步，该过程采用的技术是。检测目的基因是否成功翻译出蛋白质A.

20、分子水平检测 B.个体生物学水平的鉴定DNA分子杂交技术分子杂交技术抗原-抗体杂交检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因检测目的基因是否成功转录出mRNA三.基因工程的基本操作程序4.目的基因的检测与鉴定：DNA分子杂交法：其基本原理是具有一定同源性的两条DNA单链，在一定条件下（适宜的温度等）可以按照碱基互补配对原则形成双链。杂交过程中，杂交的双方是待测的DNA和用放射性同位素标记的已知DNA片段（又称为基因探针）。若待测DNA中有能与探针互补的特异性DNA片段，用于示踪的放射性同位素标记会指示出其所在的位置，表明目的基因已插入转基因生物染色体的DNA中（如图)。基因探针:一般是指一小段

21、单链DNA或RNA，能与目的基因的一条链碱基互补配对，并带有放射性同位素标记或荧光标记。例如胰岛素基因探针，既能与胰岛素基因的一条链形成杂交分子，也可与胰岛素基因转录形成的mRNA形成杂交分子。用胰岛素基因探针既可以检测受体细胞中是否含有胰岛素基因，也可以检测胰岛素基因是否转录。人体的细胞中，胰岛B细胞的(DNA/RNA/DNA和RNA)能与胰岛素基因探针形成杂交分子，而其他细胞中只有(DNA/RNA)能与之形成杂交分子。DNA 和RNADNA提取苏云金杆菌Bt毒蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒蛋白的抗体抗体蛋白质出现杂交带脱分化组织培养探针:32PP转基因生物的m

22、RNA:杂交带三.基因工程的基本操作程序b.活性比较实验:将基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同。B.个体生物学水平的鉴定a.检测生物是否具有该蛋白质赋予的某种特性以及具有该特性的程度。如：抗虫：做抗虫接种实验，观察（害虫/生物）的生存状况抗病：做病原体接种实验，观察（病原体/生物）的生存状况抗盐：将转基因植物移栽到。抗寒：将转基因植物移栽到环境中，观察其生长状况盐碱地害虫生物低温（寒冷）三.基因工程的基本操作程序4.目的基因的检测与鉴定：【思维探究】(1)已知真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的

23、机制。某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是。(2)人体合成的初始胰岛素，需要经过膜系统加工形成特定的空间结构才有生物活性，把胰岛素基因导入大肠杆菌时形成的胰岛素没有生物活性，原因是。(3)为了避免抗虫基因通过花粉传播给其他植物，应将该目的基因导入（细胞核/细胞质）中理由是。基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A大肠杆菌是原核生物，没有内质网、高尔基体，无法对形成的胰岛素进行加工细胞质细胞质基因具有母系遗传的特点三.基因工程的基本操作程序(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐

24、旱与不耐旱植株的数量比为31时，若子代全部耐旱。尝试推测该耐旱基因分别整合到了什么位置上？（答“同源染色体的一条上”或“同源染色体两条上”_，。(5)若自交子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为15：1时，则可推测该耐旱基因整合到了什么位置上？（答“同源染色体的一条上”或“两对同源染色体上”）。_。同源染色体的一条上同源染色体两条上两对同源染色体上【思维探究】三.基因工程的基本操作程序(5)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有TDNA，把目的基因插入Ti质粒的TDNA中是利用TDNA_的特点。(6)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为_。(7)目的基因能否在棉株体内

25、稳定维持和表达其遗传特性的关键是_，这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是_。可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上转化目的基因是否插入了受体生物细胞的染色体DNA上DNA分子杂交技术(8)不同种生物之间的基因移植成功，其结构基础是，也说明了不同种生物共用一套。都是双螺旋结构，均由四种脱氧核苷酸组成遗传密码三.基因工程的基本操作程序例14.下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列有关问题。(1)若限制酶的识别序列和切点是GATC，限制酶识别序列和切点是GGATCC，那么在过程中，应用限制酶_切割质粒，用限制酶_切割抗虫基因(2)将通过过程得到的大肠杆菌涂布在含有_的培养

26、基上，若能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。四环素三.基因工程的基本操作程序(3)要确定抗虫基因导入后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，则在个体水平上的鉴定过程可简述为。经筛选分析，该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论上，该转基因植株自交产生的F1代中，仍具有抗虫特性的植株占总数的_。(4)过程所用的现代生物技术运用的原理是，从遗传学角度来看，据细胞通过过程，能形成棉植株的根本原因是细胞具有。让害虫吞食转基因棉花的叶片，观察害虫的存活情况，以确定其是否具有抗虫性状3/4细胞的全能性发育成完整个体的全部遗传物质三.基因工

27、程的基本操作程序鱼票月半出品，必是精品01 02 03 04目录热点微练22/055.(2022 山 东 师 范 大 学 附 中 调 研)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR 酶切为例)：鱼票月半出品，必是精品01 02 03 04目录热点微练22/05(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤 选用的PCR引物必须是_(从引物中选择，填编号)。DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物5AACTATGCGCTCATGA35AGAGGCTACGCATTGC35GCAATGCGTAGCCTCT

28、35TCATGAGCGCATAGTT3鱼票月半出品，必是精品01 02 03 04目录热点微练22/052.(2021 山 东 潍 坊 一 模)报告基因是指一类易于检测且实验材料本身不具备的基因。阿尔茨海默病(AD)是由淀粉样前体蛋白(APP)过量表达导致的神经系统退变性疾病，用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因。将EGFP基因与 APP基因融合，可方便、经济、快速地筛选出促进人 APP基因mRNA降解的药物。研究表明，EGFP基因与 APP基因融合后，虽能全部转录但仅可合成EGFP。EGFP基因与APP基因融合过程如图所示。鱼票月半出品，必是精品01 02 03 04目录热点微练

29、22/05(1)APP751、EGFP基因的cDNA是以其mRNA为模板经过程形成的。(2)据图分析，Klenow酶的作用是_。切割pcDNA3.1质粒获得 APP751基因时，研究人员没有选择直接用 Hind、Xba 同时切割，而是历经的复杂过程，原因是_。(3)COS7细胞是来源于非洲绿猴肾成纤维细胞，培养这类细胞时，为保证细胞生长，应在合成培养基中添加。逆转录将Xba切割获得的黏性末端催化产生平末端直接用Hind、Xba 同时切割，产物两端都是黏性末端，才能与被Sma 与Hind酶切的载体连接血清等一些天然成分鱼票月半出品，必是精品01 02 03 04目录热点微练22/054.(202

30、2 济 南 模 拟)COVID19的抗原性与感染性与其表面的S蛋白(刺突糖蛋白)密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建S蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。请回答下列问题。鱼票月半出品，必是精品01 02 03 04目录热点微练22/05(3)构建好的重组质粒长度共2 000 bp，用限制酶Hind及限制酶Hind和BamH 分别对重组质粒进行切割并电泳，结果如图乙所示，可推测BamH 在重组质粒上有_个酶切位点。为使S蛋白基因在受体细胞中高效表达，需要把S蛋白基因正确插入重组质粒的_之间。(4)目前人们注射的新冠疫苗中有一种为腺病毒载体疫苗。该疫苗是

31、将S蛋白基因插入到改造之后的腺病毒基因组中，待腺病毒侵染人体后，可引发机体的免疫反应。请用文字和箭头写出腺病毒载体疫苗进入机体后产生抗体的过程_。3启动子和终止子S蛋白基因mRNAS蛋白作为抗原体液免疫抗体例 15.(2021山 东，25)人 类 基 因 启 动 子 上 游 的 调 控 序 列 中 含 有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如

32、图所示。三.基因工程的基本操作程序(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1F7末端添加的序列所对应的限制酶是_，在R末端添加的序列所对应的限制酶是_。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要_种酶。Sal EcoR6三.基因工程的基本操作程序(2)将构建的载体导入除去 BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_。F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达三.基因工程的基本操作程

33、序(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，三.基因工程的基本操作程序据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于_，理由是_F1F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上引物F4与F5在调控序根据有无荧光情况判断，_。列上所对应序列之间的区段上三.

34、基因工程的基本操作程序例12.（2020，高三，衡水）目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示：(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_。观察上图，如果A为质粒，则C表示。筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 重组质粒三.基因工程的基本操作程序(2)pBR322分子中有单个EcoR限制酶作用位点，EcoR只能识别序列GAATTC，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR切割后所形成的黏性末端。三.基因工程的基本操作程序(3)pBR322

35、分子中另有单个的BamH限制酶作用位点，现将经BamH处理后的质粒与用另一种限制酶Bgl处理得到的目的基因，通过_作用恢复_键，成功地获得了重组质粒。能形成重组质粒的原因是_。DNA连接酶磷酸二酯键两种限制酶(BamH和Bgl)切割得到的黏性末端相同三.基因工程的基本操作程序(4)作为受体大肠杆菌应不含_，以方便筛选已导入重组质粒的受体大肠杆菌。将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_，图三结果显示，多数

36、大肠杆菌导入的是_。ampR和tetR（或氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素pBR322质粒三.基因工程的基本操作程序（5）基因工程中使用的限制酶，其特点是_，下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X1混合连接，连接后获得的质粒类型有。（可多选）AX1 BX2 CX3 DX4ABC识别双链DNA分子某种特定核苷酸序列，切割特定部位的磷酸二酯键TcrTcrAprAprE1E1E1E1E1E1E1E2 E2E2E2 E2X1X2 X3X4三.基因工程的基本

37、操作程序(6)若将上图所示X-1、X-2、X-3、X-4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上在这两种培养上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有_、_无质粒细胞TcrTcrAprAprE1E1E1E1E1E1E1E2 E2E2E2 E2X1X2 X3X4含X-3的细胞三.基因工程的基本操作程序（7）图1为某种常用质粒的序列图，LacZ基因编码的酶能使无色的Xgal变为蓝色，Ampr为氨苄青霉素抗性基因图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列请回答下列问题：实验小组用BamH和Blg两种限制酶切割目的基因和质粒，若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质

38、有和 氨苄青霉素 Xgal三.基因工程的基本操作程序（7）图1为某种常用质粒的序列图，LacZ基因编码的酶能使无色的Xgal变为蓝色，Ampr为氨苄青霉素抗性基因图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列请回答下列问题：成功导入重组质粒的大肠杆菌菌落显，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入没有导入任何外源DNA的大肠杆菌（填“能”或“不能）在该培养基上生存白色无目的基因的空质粒不能三.基因工程的基本操作程序（8）为制备目的基因Y（图19）与质粒X（图20）的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性核酸内切酶BgI与BamH的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR要筛选含有重组质粒的Z细胞，应选择的培养基。含卡那霉素但不含亮氨酸的培养基三.基因工程的基本操作程序