GB∕T 23527.1-2023 酶制剂质量要求 第1部分：蛋白酶制剂.pdf

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1、ICS 67.220.20CCS X 69(3B中华人民共和国国家标准GB/T 23527.12023代替 GB/T 235272009酶制剂质量要求 第1部分：蛋白酶制剂Quality requirements for enzyme preparationsPart 1：Protease preparations2023-03-17 发布2024-04-01 实施国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会GB/T 235 27.12023-lu.刖 R本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规 定起草。本文件规定了食品质量相关技术要求。食品安全

2、相关要求见有关法律法规、政策和食品安全标准 等文件。本文件是GB/T 23527酶制剂质量要求的第1部分。GB/T 23527已经发布了以下部分：第1部分:蛋白酶制剂。本文件代替GB/T 235272009蛋白酶制剂，与GB/T 235272009相比，除结构调整和编辑性 改动外，主要技术变化如下：增加了术语“蛋白酶制剂”“蛋白酶活力单位”（见3.2、3.3）；更改了“蛋白酶活力”的定义（见3.4,2009年版的3.2）；更改了理化要求中的“酶活力”要求（见表2,2009年版的表1）；删除了“卫生要求”（见2009年版的5.3）；更改了干燥失重和细度的试验方法（见6.3.6.4,2009年版的

3、6.3,6.4）；更改了出厂检验项目（见7.3,2009年版的7.3.1）；更改了标志的内容（见8.1,2009年版的8.1）；删除了“保质期”（见2009年版的第9章）；删除了“国内常用蛋白酶制剂的类别、代号与生产菌”的清单（见2009年版的附录A）；增加了“蛋白酶活力的测定福林法”中其他缓冲溶液（见A.3.8.4）；增加了“蛋白酶活力的测定紫外分光光度法”中的其他底物（见B.3）；更改了“碱性蛋白酶活力的测定 全自动生化分析法”中的试剂（见C.3,2009年版的D.4）；增加了“蛋白酶活力的测定 微量比色法”的试验方法（见附录D请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别

4、专利的责任。本文件由全国食品工业标准化技术委员会（SAC/TC 64）提出并归口。本文件起草单位：中国食品发酵工业研究院有限公司、中国生物发酵产业协会、诺维信（中国）投资 有限公司、山东隆科特酶制剂有限公司、杰能科（中国生物工程有限公司、武汉新华扬生物股份有限公 司、英联酶制剂贸易（上海）有限公司、白银赛诺生物科技有限公司、广州焙乐道食品有限公司、湖南新鸿 鹰生物工程有限公司、帝斯曼（中国）有限公司、青岛蔚蓝生物集团有限公司、天野酶制剂（江苏）有限公 司上海分公司、安琪醵制剂（宜昌）有限公司、江苏奕农生物股份有限公司、南京百斯杰生物工程有限公 司、宁夏夏盛实业集团有限公司、北京昕大洋科技发展有

5、限公司、河南新仰韶生物科技有限公司、青岛根 源生物技术集团有限公司、山东省鲁洲食品集团有限公司、浙江养生堂天然药物研究所有限公司、中山 市南方新元食品生物工程有限公司。本文件主要起草人:刘明、陈楠楠、王晋、张峻炎、郭庆文、齐延芳、周樱、裴静、俞峰、童远洋、黄石桥、杜建华、陈亮珍、王友谊、杜支红、常东民、徐红、沈涛、郭宝林、焦国宝、张宗国、赵玉斌、黄志明、刘高峰、郭新光、王洁、王金凤、钱娟娟、王健蕾、徐丽、权中华、杨忠义、高铁成、易鸣、袁琳、邵静、李英玉、喻晨、王俊峰、朱伟、程伟、余艳、何景阳、邓娟娟、周莉芬、王校冬、田天娥。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：本文件于2009年首次发布；

6、-本次为第一次修订。IGB/T 235 27.12023引 言随着酶制剂工业的迅速发展，酶制剂种类向多元化发展，产品质量提高到一个新的水平，行业从技 术到品种都有了长足的进步与发展。制定GB/T 23527酶制剂质量要求，是对酶制剂的产品质量和 检测方法的规范化和标准化，是规范酶制剂及相关产品行业秩序、促进产业发展的基础性工作。GB/T 23527酶制剂质量要求拟由四个部分构成：第1部分:蛋白酶制剂；第2部分:脂肪酶制剂；第3部分:a-淀粉酶制剂；第4部分：固定化葡萄糖异构酶制剂。随着蛋白酶制剂行业产品创新发展，根据行业产品调研和征集产品种类，除了原标准范围涵盖的微 生物发酵来源的蛋白酶制剂产

7、品，还有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等植物组织提取产品和 胃蛋白酶、胰蛋白酶等动物组织提取产品。另外，根据国内外检测方法行业产品发展需要，在本次修订 中，对GB/T 235272009酶活力测定方法的测定条件进行了更新完善，并增加了微量比色法。GB/T 23527.12023酶制剂质量要求 第1部分：蛋白酶制剂1范围本文件规定了蛋白醉制剂的产品分类、要求、检验规则、标志、包装、运输和贮存，并描述了试验 方法。本文件适用于微生物发酵或植物组织来源的蛋白酶制剂的生产、检验和销售。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日

8、期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。GB/T 191包装储运图示标志GB/T 601化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T 602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备GB/T 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法QB/T 1803工业酶制剂通用试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1蛋白酶protease能催化水解蛋白质分子内部的肽键，使其转化为多肽或氨基酸的酶。3.2蛋白酶制剂 protease preparations以提取、纯化的蛋白酶为主要催化活性组分，通过制剂等工艺制得

9、的产品。注：制剂工艺中可加入有助于产品贮存、稳定和使用的配料。3.3蛋白醯活力单位 activity unit of protease在一定温度和pH条件下，1 min水解酪蛋白产生1/zg酪氨酸所需的蛋白酶量，即为1个酶活力 单位。注：以“U”表示。3.4蛋白酶活力 protease activity蛋白酶制剂的酶活力 activity of protease preparations催化蛋白质水解为多肽和氨基酸的能力，表示为1 g固体蛋白酶制剂（或1 mL液体蛋白酶制剂）含 有的酶活力单位。1GB/T 23527.12023注：以U/g或U/mL表示。4产品分类4.1 按产品的应用领域食品

10、工业用和其他工业用蛋白酶制剂。4.2 按产品的形态固体剂型和液体剂型蛋白酶制剂O4.3 按产品的作用pH范酸性、中性和碱性更白醒5要求规定浅黄或颗聚物理化要应符合表。物规定表2理化要求体劈7液体剂型酶活力/(U/g 或 U/mL)称符合声称干燥失重17%）/%80,也可按供需双方约定前活力要求执行。不适用于颗粒产品。6试验方法6.1 感官要求称取样品10 g或1。mL于洁净、干燥白瓷盘，观察、嗅闻，作出判断，做好记录。2GB/T 23527.120236.2 酶活力按附录A进行检测，也可参考附录B、附录C、附录D或采用其他方法进行检测。检测结果应标明 测定的方法，必要时,还应标明缓冲溶液和底物

11、。6.3 干燥失重按QB/T 1803中干燥失重的试验方法执行。6.4 细度按QB/T 1803中细度的试验方法执行，标准试验筛选择+200X500.40/0.25。7检验规则7.1 批次同原料、同配方、同工艺、同生产线连续生产的产品为一批。7.2 抽样抽样的样本量可按照表3执行，或由生产企业和（或）相关方确定。每个最小外包装单位的取样量 应不小于300 g或300 mL,不足时按照比例适当加取。充分混合均匀后进行检验。表3抽样的样本量批量范围（垠小外包装单位）抽样的样本量（最小外包装单位）50（含）以下251 500（含）3500以上4注：批量范围是指批中所包含的最小外包装单位数量。抽样的样

12、本量是指抽取样本的最小外包装单位数证。7.3 出厂检验7.3.1 产品出厂前，应由生产厂的质检部门负责按本文件规定逐批进行检验。检验符合本文件后方可 出厂。7.3.2 检验项目如下：a）固体剂型的检验项目：感官要求、酶活力、干燥失重、细度。b）液体剂型的检验项目：感官要求、酶活力。7.4 型式检验检验项目：本文件中全部要求项目。一般情况下，同一类产品的型式检验每年至少进行一次，有下 列情况之一者，亦应进行：a）原辅材料有较大变化时；b）更改关键工艺或设备时；c）新试制的产品或正常生产的产品停产3个月后，重新恢复生产时；d）出厂检验与上次型式检验结果有较大差异时；3GB/T 23527.1202

13、3e）国家监督机构按有关规定需要抽检时。7.5 判定规则7.5.1 抽取样品经检验，所检项目全部符合要求，判该批产品符合本文件。7.5.2 检验结果如有两项以上指标不符合要求，判定该批产品不符合本文件。如有一项至两项不符合 要求，应重新自同批产品中抽取样本量的两倍进行复检，以复检结果为准。若仍有一项不符合要求，判 定该批产品不符合本文件。7.5.3 当供需双方对检验结果有异议时，可由双方协商解决，或委托有关单位进行仲裁检验，以仲裁检 验结果为准。8 标志、包装、运输和贮存 期匚:二匚二一一-一.一8.1 标志8.1.1 销售专装使沙粽时,应标注产品类型和酶活力。8.1.2 包装贮运图示侬应符合

14、GB/T 191的要求上82 包装包装容器应整洁、无争十魂羯&给城帝编为意运输工期应清洁卫翦:应与有毒、辘射腐蚀懒含有异缝压、暴晒。装卸时,应轻拿包装8.4 贮 A 异味的物品叫装、畔，杂 免受潮、受翳/毒露氟着腐蚀性和含有 FGB/T 235 27.12023附录A(规范性)蛋白酶活力的测定福林法A.1原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸,在碱性条件下，还原 福林试剂生成铝蓝与鸨蓝,用分光光度计于波长680 nm处测定溶液的吸光度。酶活力与吸光度成正 比，由此可以计算产品的酶活力。A.2仪器和设备A.2.1电子天平:感量为0.1 mgoA.2.2分光光度计

15、。A.2.3恒温水浴锅。A.2.4 pH 计:精度为 0.01。A.3试剂和溶液本方法中所用的水，在未注明其他要求时,应符合GB/T 6682中三级水的规格，所用试剂，在未注 明其他规格时，均指分析纯。分析中所用标准滴定溶液,杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明 其他要求时，均按GB/T 601.GB/T 6O2,GB/T 603的规定制备。A.3.1福林试剂于2 L磨口回流装置中分别加入100.0 g鸨酸钠(NazWCh-2 H2O).25.0 g铝酸钠(Na2Mo e 2H2 0),700 mL水、50 mL磷酸(85%)、100 mL浓盐酸，小火沸腾回流10 h,取下回流冷却器，在

16、通风 橱中加入50 g硫酸锂(Li2SC)4)、50 mL水和数滴浓溪水(99%),再微沸15 min,以除去多余的澳(冷后 仍有绿色需再加溟水，再煮沸除去过量的溟)，冷却，转移至1 000 mL容量瓶中，蒸储水定容，混匀并过 滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。A.3.2福林使用溶液量取50 mL福林试剂(A.3.D和100 mL水，混合均匀。注：也可使用市售福林溶液配制。A.3.3碳酸钠溶液(0.4 mol/L)称取42.4 g无水碳酸钠(Na2co3),用水溶解并定容至1 L。A.3.4 三氯乙酸(0.4 moI/L)称取65.4 g三氯乙酸，用水溶解并定容至1 L。A.3.5氯氟

17、化钠溶液(20 g/L)称取20.0 g氢氧化钠，加水900 mL并搅拌溶解。待溶液到室温后水定容至1 L。5GB/T 235 27.12023A.3.6 盐酸溶液(1.0 mol/L)移取8.3 mL浓盐酸于盛有80 mL水的容量瓶中，水定容并摇匀。A.3.7 盐酸溶液(0.1 mol/L)移取0.83 mL浓盐酸于盛有80 mL水的容量瓶中，水定容并摇匀。A.3.8缓冲溶液A.3.8.1磷酸缓冲溶液(pH=7.5,适用于中性蛋白酶制剂)分别称取6.02 g磷酸氢二钠(NazHPO,-12H2。)和0.5 g磷酸二氢钠(NaH2P52H20),加水 溶解并定容至1 000 mL。盐酸溶液(A

18、.3.6)或氢氧化钠溶液(A.3.5)调节pH至7.500.05oA.3.8.2现酸钠缓冲溶液(pH=3.0,适用于酸性蛋白酶制剂)称取4.71 g乳酸(80%90%)和0.89 g乳酸钠(70%)于900 mL水中，搅拌溶解后，用乳酸或乳酸 钠调整pH至3.000.05,定容至1 000 mL。A.3.8.3硼酸缓冲溶液(pH=10.5,适用于碱性蛋白酶制剂)称取9.54 g硼酸钠、1.60 g氢氧化钠于烧杯中，加水900 mL,搅拌至均匀。用盐酸溶液(A.3.6)或 氢氧化钠溶液(A.3.5)调整pH至10.50.05,定容至1 000 mL0A.3.8.4其他缓冲溶液生产者和使用者还可以

19、探讨使用表A.1中缓冲溶液或其他适用的缓冲体系。表A.1其他缓冲溶液参考配制方法缓冲体系参考配制方法乙酸钠缓冲溶液(pH=4.7)称取4.10 g无水乙酸钠于900 mL水中，充分溶解后，加入3.00 g冰乙酸。再用盐酸溶液(A.3.6)或氢氧化钠溶液(A3.5)调整pH至4.70.05,水定容至1 000 mL磷酸盐缓冲溶液(pH=6.0)称取17.9 g十二水合磷酸氢二钠(NazHPO,12凡。)于800 mL水中，充分溶解后，盐酸溶液(A.3.6)调节pH至6.00.05,加水定容至1 000 mLTirs缓冲溶液(pH=8.5)称取6.06 g 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇

20、(Tris碱)于800 mL水中，充分溶解后，盐酸溶液(A.3.6)或氢氧化钠溶液(A3.5)调节pH至8.50.05,加水定容至1 000 mLA.3.9 底物溶液(10.0g/L)称取1.00 g蛋白酶制剂专用酪蛋白底物(精确至0.001 g)于烧杯中，加入相应的缓冲溶液约 80 mL,置于沸水浴保持30 min,期间不断搅拌至酪蛋白全部溶解。冷却至室温后转入100 mL容量瓶 中，盐酸溶液(A.3.6)或氢氧化钠溶液(A.3.5)调节至相应pH后，用相应pH缓冲溶液定容。此溶液 4 保存，有效期为3 d0使用前重新确认并调整pH至规定值。不同来源或批号的酪蛋白对试验结果有影响。如使用不同

21、的酪蛋白作为底物，使用前应与以上蛋 白酶制剂专用酪蛋白底物进行结果比对。6GB/T 23527.12023A.3.10 L-酪氨酸标准储备溶液（100 jtg/mL）称取0.100 g经105 干燥至恒重的L-酪氨酸（精确至0.000 1 g）于烧杯中，加入60 mL盐酸溶液（A.3.6）,充分溶解后转移至100 mL容量瓶中，盐酸溶液定容并摇匀。再吸取10.00 mL至100 mL容 量瓶中，用0.1 mo l/L盐酸溶液（A.3.7）定容并摇匀。A.4分析步骤A.4.1标准曲线的绘制A.4.1.1 L-酪氨酸系列标准工作溶液按表A.2配制。表A.2 L-酪氨酸系列标准工作溶液管号L-酪氨酸

22、标准溶液的浓度 mg/mLL-酪氨酸标准储备溶液（A.3.9）的体积 mL加水的体积 mL000101101922028330374404655055A.4.1.2 分别取1.00 mL表A.2中标准溶液于玻璃试管中，加入5.00 mL碳酸钠溶液（A.3.3）和 1.00 mL福林试剂使用溶液（A.3.2）,振荡混匀，置于40 C0.2（水浴中反应20 min,取出冷却至室 温。以0管为空白，分别采用10 mm比色杯测定系列标准工作溶液在680 nm处的吸光值。以吸光值 为纵坐标,L-酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。A.4.1.3利用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量Qxg）,即为

23、吸光常数K值。其K值应在 95100范围内。如不符合，需重新配制试剂，进行试验。注：L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行泱|定。A.4.2样品的测定A.4.2.1待测酶液的制备称取L0 g蛋白酶制剂样品（精确至0.000 1 g）0加入80 mL相应缓冲溶液，搅拌溶解30 min,随后 转移至100 mL容量瓶中，用相应缓冲溶液定容并混匀。移取适量酶液加入相应缓冲溶液稀释到酶活 力在 10 U/mL-15 U/mL 之间。A.4.2.2 测定A.4.2.2.1将酪蛋白溶液置于40 0.2 恒温水浴中，预热5 min。A.4.2.2.2按表A.3程序操作。A.4.2.2.3中性蛋白酶如枯草芽抱杆菌

24、No.1.398和放线菌No.166来源，除标准曲线和样品测定的反 应温度和显色温度为30 0.29，其他操作同上。GB/T 235 27.12023表A.3操作程序步骤试管A（空白）试管B（蛋白酶样品，需做3个平行试样）1加酶液 LOO mL,40 C 士0.2 ,2 min加酶液 1.00 mL,40%：0.2 七，2 min2加三氯乙酸2.00 mL（摇匀）加酪蛋白溶液LOO mL（摇匀）340(0.2 0,10 min40 X?0.2*C 10 min4加酪蛋白溶液1.00 mL（摇匀）加三氯乙酸2.00 mL（摇匀）5取出酵置10 min,过滤（慢速定性滤纸）6取LOO mL滤液，加

25、入5.0 mL碳酸钠溶液,1.0 mL福林使用溶液,40七0.2 C,显色20 min7以试管A为空白,680 nm波长处，用10 mm比色皿测定试管B的吸光度A.4.3计算样品的酶活力按式（A.1）计算:_ Ci X Vi X 4 X1 Ml X 10(A.1)式中：Xi样品的酶活力，单位为酶活力单位每克（U/g）；c）由标准曲线得出的蛋白酶水解产生的L-酪氨酸的浓度，单位为微克每毫升Qzg/mL）；溶解样品所使用的容量瓶的体积，单位为毫升（mL）；4 反应试剂的总体积，单位为毫升（mL）；m样品的稀释倍数；啊样品的质量，单位为克（g）;10 反应时间，单位为分（min）。计算结果表示至整数

26、。A.5精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过平均值的5%。8GB/T 235 27.12023附录B资料性)蛋白酶活力的测定紫外分光光度法B.1 原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪蛋白或血红蛋白底物生成酪氨酸，加入三氯乙酸终止酶 反应,并沉淀未水解的底物，滤液中的酪氨酸使用紫外分光光度计在275 nm下进行测定。根据吸光度 与酶活力的比例关系计算其酶活力。不同的蛋白酶制剂其紫外法结果与福林法结果的换算系数不同。如需要，相关方可根据试验结果 统计,确定两个方法的换算系数。B.2 仪器和设备同 A.2。B.3 试剂和溶液同 A.3。根据蛋白酶不同性质，除A.3中使用

27、的酪蛋白底物，也可选用表B.1中规定的血红蛋白底物或其他 适宜底物。表B.1血红蛋白底物参考配制方法底物参考配制方法血红蛋白称取4.0 g血红蛋白，精确至0.001 g,加入100 mL水后搅拌10 min.用0.1 mol/L盐酸溶液调节pH 至1.70+0.05,搅拌10 min至全部溶解后,0.5 mol/L乙酸钠溶液调节pH至4.700.05,转入200 mL 容量瓶，水定容并混匀B.4 分析步骤B.4.1 求K值按福林法的表A.1配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光 度(A),并计算K值。K值应在130135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行试验

28、。B.4.2 待测醯液的制备同A.4.2.1。样品稀释液最终的浓度应该在10 U/mL20 U/mL范围之内。B.4.3 测定操作同A.4.2.2中的取液、反应、静置沉淀，直至过滤。滤液用紫外分光光度计，在275 nm波长处，测定其吸光度。注：如结果不平行，可以考虑将加入三氯乙酸的试样溶液返回到水浴中保温30 min,然后再测定吸光度。B.5 计算从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力,单位为U/mL。样品的酶活力按式(B.1)计算9GB/T 235 27.12023A2 XV2 Xh2 X4Zk 2 一 一，1 Xm2 X 10(B.l)式中：X2样品的酶活力，单位为酶活力单位每克(U/g)

29、；A2由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力，单位为酶活力单位每毫升(U/mL)；V2溶解样品所使用的容量瓶的体积，单位为毫升(mL)；n2稀释倍数；4反应试剂的总体积，单位为毫升(mL)；1 吸取酶液的体积，单位为毫升(mL)；m2样品的质量，单位为克(g);10 反应时间，单位为分(min)。结果保留至整数位。B.6精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过平均值的5%。10GB/T 235 27.12023附录C（资料性）碱性蛋白酶话力的测定 全自动生化分析法C.1原理蛋白水解酶可以水解N-琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-苯丙氨酸对硝基苯胺底物，释放出的黄色 的对硝基苯胺

30、，在405 nm处产生吸收,通过测定单位时间内吸光度的变化计算酶活力。C.2仪器和设备C.2.1全自动生化分析仪:要求带有进样系统、搅拌系统、温度控制系统（精度0.3 C）和检测系统（可 在405 nm下连续检测吸光度的变化）。C.2.2电子天平:感量为0.1 mg。C.2.3 pH 计:精度为 0.01。C.3试剂本方法中所用的水，在未注明其他要求时,需符合GB/T 6682中水的规格，所用试剂在未注明其他 规格时，均指分析纯。C3.1柠檄酸钠缓冲溶液（50 mmol/L,pH=6.0）称取10.50 g 一水合柠檬酸和0.74 g二水合氯化钙于1 L容量瓶中，加入450 mL水溶解后，加入

31、 5.33 g氢氧化钠，继续加水至980 mL左右。全部溶解后，加入0.76 g 30%聚氧乙烯月桂醛（Br ij L23）O 最后使用4 mo l/L氢氧化钠溶液调节pH至6.00.05后,水定容至刻线。C.3.2 CHES 缓冲溶液（100 mmol/L,pH=9.0）称取2.07 gCHES（N-环己基-2-氨基乙磺酸）于100 mL容量瓶中，加入70 mL水溶解。再加入 73.5 mg二水合氯化钙和76.2 mg 30%Br ij L23（聚氧乙烯月桂酸）。最后使用4 mo l/L氢氧化钠溶液 调节pH至9.00.05后，水定容至刻线。C.3.3底物储备液（5 0g/L）称取50 mg

32、 N-琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-苯丙氨酸对硝基苯胺底物（精确至0.1 mg）于10 mL 烧杯中，加入1 mL的二甲基亚碾，搅拌至全部溶解。转移至离心管中避光保存。C.3.4底物使用液（0.3 g/L）移取120 rL底物储备液（C.3.3）于20 mL容量瓶中，以CHES缓冲溶液（C.3.2）定容至刻线并 混匀。C.4分析步骤C.4.1标准曲线的制备标准储备液:称取一定量的已知活力蛋白酶标准品（精确至0.1 mg）于500 mL的容量瓶中,柠檬酸 钠缓冲溶液（C.3.1）溶解并定容得到标准储备液。标准品称取的量要使标准储备液中蛋白酶的活力为11GB/T 23527.120234.7 U

33、/Lo标准曲线的范围宜为0.12 U/L0.47 U/Lo在此范围之内方法的使用者可以选择6个不同的浓 度配制标准曲线工作溶液。根据产品特性的不同，方法的使用者可以选择其他的标准曲线范围,标准曲 线的相关系数R2应大于0.994 50注：标准储备液和标准工作液应现用现配。C.4.2样品溶液的制备称取一定量的蛋白酶样品，用柠檬酸钠缓冲溶液（C.3.D溶解及稀释。稀释的倍数应使最终稀释液 的酶活力在0.29 U/L左右。样品的最小稀释倍数为25.C.4.3步骤和参数C.4.3.1 步骤C.4.3.1.1将160 rL的底物加入到比色杯中。C.4.3.1.2 底物保温480 s,温度为37 oC.4

34、.3.1.3分别加入20 rL的空白、标准、标准对照品和样品到比色杯中。C.4.3.1.4反应63 s后开始第一次测量，然后每隔18 s测量一次。每个样品共测量9个吸光度。C.4.3.2 参数C.4.3.2.1平衡底物温度：37 C；保温时间：480 s；底物加量：160 mLoC.4.3.2.2酶反应周期温度：37；时间：63 s；样品：20/jtLoC.4.3.2.3测定周期测定模式:动力学法；波长：405 nm；曲线类型:非线性；时间：150 s；读数：9次；间隔：18 s0C.5计算C.5.1标准曲线的计算以吸光度的变化速率（OD/min）为纵坐标,蛋白酶标准工作溶液酶活力（U/L）为

35、横坐标绘制标准 曲线，标准曲线应为平滑下凹的曲线。12GB/T 23527.12023C.5.2样品酶活力的计算样品的酶活力按照式（C.D计算:式中:样品的酶活力，单位为酶活力单位每克（U/g）；由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力，单位为前活力单位每升（U/L）；-溶解样品用的容量瓶体积，单位(mL)力31 000稀释倍数；样品的质少施还蓍；醐活力承据毫居嘱单位每升的转化系C.5.3 结果的表示样品的测术平均值表示，保留3位有效数字在重燮性条,下获得的13GB/T 235 27.12023附录D(资料性)蛋白能活力的测定微量比色法D.1原理高温蛋白酶在一定的温度(如70 C)与pH条件下，水

36、解底物N-琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-苯 丙氨酸对硝基苯胺，产生黄色的对硝基苯胺,用分光光度计于波长414 nm处测定溶液的吸光度。酶活 力与吸光度成比例，由此可以计算产品的酶活力。D.2仪器和设备D.2.1电子天平:感量为0.1 mg。D.2.2紫外-可见分光光度计，配有200 mL微量比色杯。D.2.3恒温水浴锅。D.2.4 pH 计:精度为 0.01。D.3试剂和溶液D.3.1氯氟化钠溶液(10 mol/L)称取40.0 g氢氧化钠，加水90 mL搅拌溶解。冷却至室温后，以水定容至100 mL。D.3.2 HEPES 缓冲溶液(0.1 mol/L,pH=7.5)称取5.98 g(精确

37、至0.1 mg)4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸于200 mL水中，搅拌溶解后，10 mo l/L氢氧化 钠溶液调节溶液pH至7.5士0.05,再用水定容至250 mL。注：生产者和使用者还可以探讨使用其他适用的缓冲体系。D.3.3 底物储备液(2.0 mmol/L)称取10.0 mg N-琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-苯丙氨酸对硝基苯胺于离心管中，加入8 mL HEPES缓冲溶液(D.3.2),密封并避光处理后，在60七水浴中加热30 min90 min。待底物全部溶解 后,转移至冰水浴5 min。此时底物溶液应为半透明均匀液体，如出现溶液变黄，则表明底物已分解，需 重新配制。此溶液使用时应保存在冰

38、水浴中。分装后一20 C可保存30天，不可反复冻融。D.3.4蛋白酶标准储备溶液(40 U/mL)称取适量已知酶活力的蛋白酶标准品，精确至0.1 mg,用HEPES缓冲溶液(D.3.2)溶解后定容至 10 mLoD.4分析步骤D.4J底物使用溶液向底物储备液(D.3.3)中分次加入一定量HEPES缓冲溶液(D.3.2),再吸取20/zL每次稀释后的底 物溶液加入980 mL HEPES缓冲溶液,直至混匀后在313 nm波长处测定吸光值在0.380.40之间。14GB/T 23527.12023D.4.2标准曲线的绘制D.4.2.1蛋白酶系列标准溶液：按表D.1配制。表D.1蛋白酶系列标准溶液液

39、中的其他管号蛋白曲标准溶液的浓度 U/mL标准储备溶液（D.3.4）的体积缓冲溶液（D.3.2）的体积 以0001 00011.4 V9652955360940490*9105110、,8906f,5.8145一 叫120准确,D.4.2.2 蛋白醵失D.4.2.3D.4.3样品的测定步骤迅速转移至冰水浴中，保持2 minlOd uL至10 mm微量比色皿中，以试管A为空白，4寸仔处测碑管B的吸光度&吸光度纵坐标，酶活浓度为横坐标会麻fyy*D.4.3.1待测酶液的制备称取1.0 g蛋白酶样品，精确至0.000 1 go加入80 mL相应缓冲溶液，搅拌溶解不少于30 min,随 后转移至100

40、 mL容量瓶中，用相应缓冲溶液定容并混匀。移取适量酶液加入相应缓冲溶液稀释到一 定浓度，推荐浓度范围为酶活力1.5 U/mL5 U/mL。D.4.3.2 测定对于高温蛋白酶样品，测定步骤前先将样品溶液放入70 0.2 C恒温水浴中，预热90 min,使溶液中的其他蛋白酶失活。按表D.3程序操作。15GB/T 235 27.12023表D.3操作程序步骤试管A(空白)试管B(样品溶液，需做3个平行试样)145 样品溶液45 rL样品溶液2120/zL底物溶液120/xL底物溶液37010.2七，准确反应20 min4迅速转移至冰水浴中，保持2 min5分别吸取100*L至10 mm微量比色皿中，以试管A为空白，414 nm处测定试管B的吸光度D.4.4计算样品的酶活力按式(D.1)计算：=A3XV3Xn4.（D.1）式中：X样品的酶活力，单位为酶活力单位每克(U/g)；A3由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力，单位为酶活力单位每毫升(U/mL)；匕溶解样品所使用的容量瓶的体积，单位为毫升(mL)；L样品的稀释倍数；样品的质量，单位为克(g)。所得结果表示至整数。D.5精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过平均值的5%。16