DNA的复制、修复与重组DNA技术.ppt
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1、第十二章第十二章 DNA DNA的复制、修复与重组的复制、修复与重组转转 录录翻翻 译译复复 制制遗传信息的传递遗传信息的传递遗传信息的表达遗传信息的表达 分子生物学中心法则(centraldogma)1958 1958年年 CrickCrick 1970 1970年年 TeminTemin和和 BaltimoreBaltimore DNA RNA DNA RNA 蛋白质蛋白质 转 录翻 译逆转录 复 制第一节第一节 DNA DNA复制的原则复制的原则半保留复制(semiconservativereplication)半不连续复制(semi-discontimuousreplication)R
2、NA引物复制起始点和复制方向一、半保留复制一、半保留复制定义:亲代定义:亲代DNADNA分子的两条链可以分别作为模板,分子的两条链可以分别作为模板,按碱基互补配对原则,指导按碱基互补配对原则,指导DNADNA新链的合成。新合新链的合成。新合成的两个子代成的两个子代DNADNA分子,碱基序列与亲代分子,碱基序列与亲代DNADNA分子完分子完全一样,但一条链来自亲代全一样,但一条链来自亲代DNADNA链,另一条链是新链,另一条链是新合成的合成的DNADNA链。链。二、半不连续复制二、半不连续复制53353555335335定义:定义:DNADNA复制时,一条链是连续复制,另一条链是不复制时,一条链
3、是连续复制,另一条链是不连续复制,称半不连续复制。连续复制,称半不连续复制。前导链前导链(leading strand)(leading strand):在引物的在引物的33端按端按5 5 3 3 方向方向连续不断地合成的连续不断地合成的DNADNA链。链。随从链随从链(lagging strand)(lagging strand):在引物的在引物的33端按端按5 3 5 3 方向方向不连续合成的不连续合成的DNADNA链。链。冈崎片段冈崎片段(Okazaki fragmentOkazaki fragment):):后随链上不连续合成的后随链上不连续合成的1000100020002000或或1
4、00 100 200200个核苷酸组个核苷酸组成的成的DNADNA小片段。小片段。三、三、三、三、RNARNARNARNA引物引物引物引物定义:定义:定义:定义:DNADNADNADNA复制时,子链复制时,子链复制时,子链复制时,子链5555端的一段寡聚核糖端的一段寡聚核糖端的一段寡聚核糖端的一段寡聚核糖 核苷酸链,能为核苷酸链,能为核苷酸链,能为核苷酸链,能为DNADNADNADNA聚合酶提供聚合新聚合酶提供聚合新聚合酶提供聚合新聚合酶提供聚合新 的脱氧核的脱氧核的脱氧核的脱氧核糖核苷酸所需的糖核苷酸所需的糖核苷酸所需的糖核苷酸所需的3OH3OH3OH3OH,最后,最后,最后,最后 可被切除
5、。可被切除。可被切除。可被切除。意义:提供新的脱氧核糖核苷酸聚合所需的意义:提供新的脱氧核糖核苷酸聚合所需的意义:提供新的脱氧核糖核苷酸聚合所需的意义:提供新的脱氧核糖核苷酸聚合所需的3OH3OH3OH3OH 保证复制起始部位的真实性保证复制起始部位的真实性保证复制起始部位的真实性保证复制起始部位的真实性35DNADNA模板模板35DNADNA模板模板RNARNARNARNA引物引物引物引物5OH-3RNARNARNARNA引物引物引物引物5OH-33引物酶(引物酶(RNARNA聚合酶)聚合酶)第二节第二节 参与参与DNADNA复制的一些酶类和蛋白质复制的一些酶类和蛋白质一、原核生物大肠埃希菌
6、的一、原核生物大肠埃希菌的DNADNA聚合酶聚合酶1 1、DNADNA聚合酶聚合酶(KornbergKornberg酶)酶)发现发现:1955:1955年年 Arshur.Kornberg Arshur.Kornberg(阿瑟(阿瑟.康恩伯格)康恩伯格)1959 1959年年 诺贝尔生理和医学奖诺贝尔生理和医学奖 活性活性:大片段大片段 5 5 33聚合酶活性聚合酶活性 和和 3 5 3 5外切酶活性外切酶活性 小片段小片段 5 3 5 3外切酶活性外切酶活性5 35 3外切外切5 35 3聚合聚合3 53 5外切外切NC大片段大片段 Klenow Klenow片段片段小片段小片段罗杰罗杰.科
7、恩伯格接受父亲(左)的祝贺科恩伯格接受父亲(左)的祝贺 The Nobel Prize in Chemistry 2006for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcription Roger D.Kornberg 罗杰罗杰.科恩伯格科恩伯格5 35 3外切酶活性外切酶活性功能:切除功能:切除RNARNA引物引物 切除突变片段,在切除突变片段,在DNADNA损伤修复中起作用损伤修复中起作用5 35 3聚合酶活性聚合酶活性 功能:填补片段切除后的空缺功能:填补片段切除后的空缺3 53 5外切酶活性外切酶活性T5353T功能
8、:校读功能(功能:校读功能(proof readingproof reading)意义:保证意义:保证DNADNA复制的高度真实性复制的高度真实性 DNADNA聚合酶聚合酶 多功能酶多功能酶KlenowKlenow片段片段 常用的工具酶常用的工具酶53352 2、DNADNA聚合酶聚合酶 活性:活性:5 3 5 3聚合酶活性聚合酶活性 3 5 3 5外切酶活性外切酶活性 功能:功能:不确切不确切 3 3、DNADNA聚合酶聚合酶组成:多亚基复和物组成:多亚基复和物全酶全酶 核心酶(核心酶()22 连接二聚体(连接二聚体(2 2)单个运载夹钳复合物单个运载夹钳复合物(2 2)4 4 2功能:功能
9、:亚基亚基 5 3 5 3聚合聚合 亚基亚基 3 5 3 5外切外切 亚基亚基 连接连接 2 2亚基复合物亚基复合物 钳夹钳夹 亚基亚基 钳夹、滑动钳夹、滑动 特点:高续进性特点:高续进性 (5050万个脱氧核糖核苷酸)万个脱氧核糖核苷酸)高效性高效性 (10001000个脱氧核糖核苷酸个脱氧核糖核苷酸/秒)秒)高保真实性(校读功能)高保真实性(校读功能)二、真核生物的二、真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶:聚合酶:、五种五种功能:功能:DNADNA聚合酶聚合酶 聚合随从链聚合随从链 DNA DNA聚合酶聚合酶 聚合前导链聚合前导链 (协同增殖细胞核抗原(
10、协同增殖细胞核抗原PCNAPCNA)DNA DNA聚合酶聚合酶 聚合线粒体聚合线粒体DNADNA DNA DNA聚合酶聚合酶、校读功能、参与校读功能、参与 DNA DNA损伤修复损伤修复三、解链、解旋酶类和蛋白质三、解链、解旋酶类和蛋白质(大肠杆菌(大肠杆菌E.E.colicoli)1 1、DNADNA解链酶解链酶 功能:解开功能:解开DNADNA双链双链 条件:需要条件:需要ATPATP供能供能 ,2 2个个ATP/ATP/对碱基对碱基 2 2、单链、单链DNADNA结合蛋白结合蛋白 功能:维持模板单链状态功能:维持模板单链状态 保护模板不受核酸酶水解保护模板不受核酸酶水解 DNA DNA拓
11、扑异构酶拓扑异构酶 功能:暂时切断双链中的一股,功能:暂时切断双链中的一股,另一另一股链旋转通过该缺口,股链旋转通过该缺口,张力张力下降后,再连接缺口下降后,再连接缺口 DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶 功能:暂时切断双链中的两股,功能:暂时切断双链中的两股,断端旋转,断端旋转,张力下降后,张力下降后,再连接缺口再连接缺口 条件:需要条件:需要ATPATP供供能能3 3、DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶4 4、引发体、引发体组分:组分:DnaA DnaA 辨认并结合至复制起始部位辨认并结合至复制起始部位 DnaB DnaB 解链酶作用解链酶作用 DnaC DnaC 帮助帮助DnaBDnaB结合
12、至复制起始部位结合至复制起始部位 引物酶引物酶 RNA RNA聚合酶,合成聚合酶,合成RNARNA引物引物5 5、连接酶、连接酶功能:催化两段功能:催化两段DNADNA链间形成链间形成3 53 5磷酸二酯键磷酸二酯键特点:只能催化双链特点:只能催化双链DNADNA链上的一股或两股链的连接链上的一股或两股链的连接555533555533355555555553333第三节第三节 DNA DNA复制过程(复制过程(大肠埃希菌)大肠埃希菌)模板:单链模板:单链DNADNA引物:引物:RNARNA引物引物原料:原料:dNTPdNTP(dATPdATP、dGTP dGTP、dCTP dCTP、dTTP
13、dTTP)聚合酶:聚合酶:DNADNA聚合酶聚合酶辅助因子:辅助因子:MgMg2 2其它:酶和蛋白因子其它:酶和蛋白因子方向:方向:5 35 3一、复制的起始一、复制的起始1 1、复制起始部位、复制起始部位orioriC C 单一:原核生物通常只有一个复制起始点单一:原核生物通常只有一个复制起始点 特定:高度保守序列特定:高度保守序列 GATCGATCTNTTNTTTTTNTTNTTTT DnaADnaA结合位点结合位点 真核生物有多个复制起始点真核生物有多个复制起始点GATCGATCTNTTNTTTTTNTTNTTTTTTATCCACATTATCCACADnaADnaADnaADnaADna
14、A:DnaA:结合至结合至orioriC C的的4 4个个DnaADnaA结合位点,形成起始复合物结合位点,形成起始复合物 作用于作用于orioriC C的的3 3个个13bp13bp序列,序列,DNADNA在此处解链,在此处解链,形成开放型起始复合物形成开放型起始复合物DnaC:DnaC:DnaB:DnaB:解开复制起始部位的解开复制起始部位的DNADNA双链双链 帮助帮助DnaBDnaB结合至复制起始部位结合至复制起始部位单链结合蛋白:单链结合蛋白:稳定并保护已解开的稳定并保护已解开的DNADNA单链单链引物酶:引物酶:RNA RNA聚合酶,合成聚合酶,合成RNARNA引物引物 维持模板单
15、链状态维持模板单链状态2 2、复制方向、复制方向双向复制双向复制复制眼(泡):复制眼(泡):DNADNA复制时,局部解开复制时,局部解开DNADNA的双链,的双链,在电镜下呈眼泡状突起在电镜下呈眼泡状突起复制叉:复制叉:DNADNA复制时,局部复制时,局部DNADNA双链解开,在复制双链解开,在复制前进部位两侧形成的前进部位两侧形成的Y Y型或叉状结构型或叉状结构真核生物真核生物DNADNA复制复制原核生物原核生物DNADNA复制复制二、复制的延长二、复制的延长DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶 解旋解旋DNADNA聚合酶聚合酶 催化催化3 53 5磷酸二酯键形成,聚合磷酸二酯键形成,聚合DNA
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